הפרוטוקול שלנו מאפשר לחוקרים לנתח את תהליך ה-arteriogenesis in vivo על ידי מעקב אחר היצמדות תאי מערכת החיסון ואקסטרווסציה בגידול עורקים בטחונים בזמן אמת. טכניקת המיקרוסקופ הרב-פוטוני מאפשרת הדמיה של דינמיקה תאית ברקמה העמוקה של מודלים של עכברים חיים עם פוטוטוקסיות נמוכה ועם רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה. הליך המיקרוסקופ יודגם על ידי דומיניק ואן דן היובל, עוזר טכני מפלטפורמת הדמיה מולטיפוטון מהמעבדה של ד"ר הלן אישיקאווה-אנקרהולד.
אני אדגים את ההליך הכירורגי. כדי להתחיל, מקם את העכבר המרדים במצב שכיבה. לאחר מכן הניחו שתי חתיכות של חימר יצוק מתחת לגפה האחורית העליונה של העכבר כדי להבטיח מיקום מישורי של שריר האדוקטור.
מקם את העכבר מתחת למיקרוסקופ הסטריאו. לאחר הסרת השיער משתי הרגליים, יש לחטא ולחתוך את העור במעגל סביב הצלקת של קשירת עורק הירך הקודמת של הגפה האחורית הימנית. הסר את העור ואת שכבת השומן מהחלק העליון של הרגל ומשוך הצידה את העור שנותר באמצעות תפרים כדי ליצור כיס סביב שריר האדוקטור עם כלי הדם הקולטרליים.
לאחר מכן, להסיר את השומן תת עורי כדי לקבל חזון ברור של שריר adductor, עורק profunda ווריד, כמו גם את כלי הדם. הסר את שכבת השריר השטחית על גבי כלי הדם הבטחוניים באמצעות מלקחיים עדינים. מלאו את הכיס המוכן במי מלח כדי למנוע מהרקמה להתייבש והמשיכו באותו הליך עבור הגפה האחורית השמאלית המופעלת על ידי דמה.
לפני ההדמיה מוסיפים ג'ל אולטראסוני לשני הכיסים המונע ייבוש ומשמש כמדיום טבילה לצימוד אופטי עם המטרה. הפעל את המפתח של תיבת הלייזר ספיר טיטניום, תיבת הממשקים האלקטרוניים, יחידת החימום של תא האינקובטור, מנורת הפלואורסצנט והמחשב. הפעל את תוכנת הרכישה.
כוונו את אורך הגל ל-800 ננומטר ופתחו את תריס המיקרוסקופ. בתיבת הדו-שיח של אשף המדידה, בחרו במצב המכשיר כאלומה יחידה ובמצב מדידה כקיטוע זמן של סריקה תלת-ממדית. לאחר מכן להעביר את העכבר המרדים לתוך תא הדגירה שחומם מראש של המיקרוסקופ ולמקם את האזור עם ג'ל קולי ישירות במגע עם העדשה הקדמית האובייקטיבית.
פתח את תריס המיקרוסקופ האפיפלואורסצנטי. לאחר מכן בחרו מסנן מתאים או הגדרה דיכרואית לתצוגה חזותית של FTSE. הגדר את תחום העניין על ידי מעקב אחר זרימת הדם תחת תאורה אפיפלואורסצנטית.
לאחר הכנסת אזור העניין לשדה הראייה המרכזי, סגרו את תריס המיקרוסקופ האפיפלואורסצנטי. בתיבת הדו-שיח סורק XY, הגדר את הפרמטרים הדרושים עבור גודל תמונה, פיקסל, תדירות, ממוצע קו. התאם את עוצמת הלייזר והגדר את רווח מכפיל התמונה עבור הערוצים בירוק, אדום וכחול.
בחר מטרה מתאימה להגדרות הדמיה תוך-חיונית ותיקון סחף. הגדירו את טווח אוסף התמונות באמצעות הפעלת מצב רכישת התצוגה המקדימה בלחיצה על הלחצן האדום בחלון הדו-שיח של אשף המדידות. כדי לקבל תמונות טובות, הגדר את האזור והמבנה של העניין על ידי התמקדות.
בעת התבוננות במסך, שנה את המיקוד על ידי הזזת המטרה עד להיעלמות התמונה והגדר אותה כאפס. הגדר את המיקום האובייקטיבי כמיקום האחרון בכיוון הצירי. לאחר מכן שנו את המיקוד בכיוון ההפוך על ידי הזזת המטרה כלפי מטה עד שהתמונה תיעלם שוב מהמסך.
לחצו על לחצן העצירה בפינה השמאלית העליונה של תיבת הדו-שיח של אשף המדידה והגדירו את גודל המדרגה לשני מיקרומטרים. בחרו בציר פיתון כהתקן הציר הראשון בתיבת הדו-שיח של אשף המדידה ובחרו 'אל תפעילו את מצב השמירה האוטומטית'. לאחר מכן סמן את תיבת השמירה האוטומטית רק בציר הזמן.
לאחר מכן, לחץ על סמל Python בחלון המכשירים הזמינים כדי לפתוח את חלון הדו-שיח Python. בהגדרות ציר הדו-שיח Python, הזן מקטעים מאת ואל ולאחר מכן הזן את מספר השלבים. עבור אל חלון הדו-שיח XYZ שלב Z והגדל את טווח הסריקה ב -200 מיקרומטר בשני הקצוות.
לשם כך, הזן 200 מיקרומטר בהתחלה והזן מינוס 240 מיקרומטר בסוף והטווח יוגדר אוטומטית כמינוס 440 מיקרומטר. פתח את תיבת הדו-שיח החזיתית של VivoFollow. התחל רכישת תמונה על-ידי לחיצה על ראש החץ הירוק בפינה השמאלית העליונה של תיבת הדו-שיח של אשף המדידה.
אם נעשה שימוש בתיקון סחף חי, חפש תיבת דו-שיח להופעת תצורת תיקון הסחף. לאחר מכן הגדר את ערוץ הרכישה המשמש כמו בהפניה לציון דרך נייד. הזינו את הסטת התיקון המרבית במיקרומטרים שנוספו למיקום Z הראשון והאחרון, ולחצו על הלחצן 'אשר'. נטר את הסטת הסחף הנוכחית ב- X, Y ו- Z בזמן אמת במהלך רכישת התמונה בחלון הדו-שיח החזיתי vivo flow והפסק את רכישת ההדמיה לאחר 35 דקות כאשר נדרש מחזור נוסף של הזרקה חוזרת של הרדמה.
הזריקו חצי מנה של תערובת MMF והפעילו מחדש את רכישת ההדמיה עד לסיום הניסוי. כלי זה מאפשר רכישת תמונה לטווח ארוך, מאפשר איסוף נתונים באיכות גבוהה ומתאים למעקב אחר התאים למדידות מהירות. כפי שמוצג ללא תיקון סחף, האזור המעניין מתרחק בהדרגה מתצוגת ההקלטה, מה שמשפיע על היכולת לעקוב אחר תאים לצורך ניתוח מהירות.
עם זאת, ניתן להקליט סרטים יציבים באמצעות תוכנת תיקון הסחף וניתן לעקוב אחר תאים נוספים לאורך תקופה ארוכה. התוכנה לתיקון סחף יכולה גם לספק תצוגה חזותית של היסט X, Y ו- Z לאורך זמן שתוקן על-ידי המערכת. מיקרוסקופ מולטיפוטון מציע רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה למעקב לויקוציטים שבו ניתן לעקוב אחר שלבי נדידת התאים ומהירותם ולנטר אותם.
על ידי הכנת כלי הדם הבטחונים להדמיית מולטיפוטונים, חיוני למנוע נזק לעורקי הבטחונות. לפני ההדמיה, חשוב לזהות בבטחה את העורק הבטחוני הנכון. עם הליך חדש זה של הדמיה multiphoton intravital של העורקים בטחונות, ניתן לנתח דבקות ו extravasation של כל תאי הדם in vivo על ידי שינוי תווית נוגדנים.
