Fornecemos um único ensaio de molécula para observar a separação de fases dos fatores de transcrição no DNA Esta técnica permite a realização em tempo real do processo dinâmico de montagem de fatores de transcrição como uma gota líquida no DNA. O EWS-FL1 é um dos genes de fusão mais frequentemente envolvidos na tumorigênese do sarcoma de Ewing. Nossa pesquisa poderia identificar a relação entre o número de motivos de DNA e a formação de condensado EWS-FL1, que está associada a uma transcrição de genes estéreis em células tumorais e talvez útil para o prognóstico.
Este método poderia ser aplicado para estudar quaisquer condensados de transcrição ou complexos in vitro, como P53 e MED1. Para preparar uma célula de fluxo com barreiras nano fabricadas em ziguezague para um experimento de cortina de DNA, conecte os tubos de entrada e saída na direção correta. Em seguida, lave a célula de fluxo com 2,5 mililitros de tampão lipídico usando duas seringas de três mililitros, garantindo que não haja bolha na célula de fluxo.
Remova a seringa da saída e injete um mililitro da solução de lipossomo três vezes com uma incubação de cinco minutos entre cada injeção. Para a cicatrização, relave a célula de fluxo com 2,5 mililitros de tampão lipídico lentamente e incube à temperatura ambiente por 30 minutos. Durante a incubação, prepare o buffer BSA conforme mencionado no manuscrito do texto.
Em seguida, após 30 minutos de cicatrização, lave a célula de fluxo com 2,5 mililitros de tampão BSA do lado de saída. Em seguida, injete 800 microlitros de tampão de estreptavidina na célula de fluxo do lado de entrada em duas etapas com uma incubação de 10 minutos após cada etapa. Em seguida, lave a célula de fluxo com 2,5 mililitros de tampão BSA para remover todas as moléculas de estreptavidina livres.
Em seguida, dilua o DNA Lambda de biotina com motivos clonados usando tampão BSA e injete-o quatro vezes lentamente em intervalos de cinco minutos. Durante a injeção, ligue o microscópio no sistema científico complementar de semicondutores de óxido de metal. Em seguida, lave a tubulação com 10 mililitros de água destilada dupla e lave o prisma e o conector da tubulação com água, limpador de cuvete líquido a 2% e etanol a 99%.
Em seguida, desenhe pelo menos 20 mililitros do tampão de imagem em uma seringa de 30 mililitros. Configure a célula de fluxo no estágio do microscópio e conecte-a ao sistema microfluídico. Usando uma taxa de fluxo de 0,03 mililitros por minuto, lave as moléculas de DNA para a barreira por 10 minutos.
Em seguida, desligue o sistema microfluídico e incube por 30 minutos. com o fluxo interrompido, permitindo que o DNA se difunda lateralmente. Para obter a imagem da formação de condensação do EWS-FLI1 em cortinas de DNA, abra o software de imagem e encontre e marque as posições dos nove padrões em ziguezague sob campo brilhante.
Em seguida, ligue o fluxo a 0,2 mililitros por minuto para manchar o DNA com corante de DNA de fita dupla por 10 minutos. Em seguida, dilua a proteína mCherry EWS-FLI1 com o tampão de imagem a uma concentração de 100 nanomoles em 100 microlitros. Em seguida, carregue a amostra de proteína através da válvula com uma seringa de vidro de 100 microlitros e altere a taxa de fluxo para 0,4 mililitros por minuto.
Depois de ligar o laser de 488 nanômetros, faça a pré-varredura de cada região para verificar o estado de distribuição do DNA e selecionar a região na qual as moléculas de DNA se distribuem uniformemente. Em seguida, defina a potência do laser para 10% para o laser de 488 nanômetros e 20% para o laser de 561 nanômetros. E usando o medidor de energia, meça a potência real do laser perto do prisma.
Comece a adquirir imagens em intervalos de dois segundos com lasers de 488 e 561 nanômetros simultaneamente. Em seguida, altere a válvula do modo manual para o modo de injeção para permitir que o tampão de imagem libere a amostra de proteína na célula de fluxo após 60 segundos. Para remover o EWS-FLI1 livre, lave a célula de fluxo com o buffer de imagem por cinco minutos com apenas o laser de 561 nanômetros ligado.
Em seguida, pare o fluxo e incube a 37 graus Celsius por 10 minutos. Após 10 minutos, ligue o fluxo a 0,4 mililitros por minuto para deixar o DNA se estender e adquirir imagens em intervalos de dois segundos entre diferentes quadros para obter dados de alto rendimento da formação de condensado EWS-FLI1. As moléculas EWS-FLI1 foram visualizadas detectando-se os sinais EWS-FLI1 marcados com mCherry obtidos com um laser de 561 nanômetros.
A formação in vitro de condensado EWS-FLI1 no local das 25 repetições GGAA no substrato de DNA pôde ser visualizada diretamente. A especificidade do mCherry EWS-FLI1 utilizado em cortinas de DNA foi confirmada por um ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética usando um molde de DNA com e sem as 25 repetições GGAA separadamente. Quando a concentração de EWS-FLI1 foi titulada de 20 a 500 nanomoles, a intensidade de EWS-FLI1 aumentou drasticamente.
Considerando que a mudança na intensidade do FLI de um DBD foi insignificante quando as proteínas foram saturadas para cobrir as repetições GGAA, sugerindo que o EWS-FLI1 formou condensados no DNA. A injeção deve ser muito lenta e macia para que o lipossomo e o DNA possam se distribuir uniformemente na célula de fluxo. É importante realizar a MSA para confirmar que um fator de transcrição purificado se liga especificamente à sequência alvo in vitro.
Essa técnica permite que as pessoas explorem se o condensado facilitará a busca alvo dos fatores de transcrição e seu efeito na transcrição.
