Forniamo un saggio a singola molecola per osservare la separazione di fase dei fattori di trascrizione sul DNA Questa tecnica consente la realizzazione in tempo reale del processo dinamico dei fattori di trascrizione che si assemblano come una goccia liquida sul DNA. EWS-FL1 è uno dei geni di fusione più frequentemente coinvolti nella tumorigenesi del sarcoma di Ewing. La nostra ricerca potrebbe identificare la relazione tra il numero del motivo del DNA e la formazione di condensati EWS-FL1 che è associata a una trascrizione genica sterile nelle cellule tumorali e forse utile per la prognosi.
Questo metodo potrebbe essere applicato per studiare eventuali condensati o complessi di trascrizione in vitro, come P53 e MED1. Per preparare una cella di flusso con barriere nano fabbricate a zigzag per un esperimento di tenda di DNA, collegare i tubi di ingresso e uscita nella direzione corretta. Quindi lavare la cella di flusso con 2,5 millilitri di tampone lipidico utilizzando due siringhe da tre millilitri, assicurandosi che non vi sia alcuna bolla nella cella di flusso.
Rimuovere la siringa dall'uscita e iniettare un millilitro di soluzione liposomica tre volte con un'incubazione di cinque minuti tra ogni iniezione. Per la guarigione, rilavare lentamente la cella di flusso con 2,5 millilitri di tampone lipidico e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Durante l'incubazione, preparare il buffer BSA come indicato nel manoscritto testuale.
Quindi, dopo 30 minuti di guarigione, lavare la cella di flusso con 2,5 millilitri di tampone BSA dal lato di uscita. Quindi, iniettare 800 microlitri di tampone streptavidina nella cella di flusso dal lato di ingresso in due fasi con un'incubazione di 10 minuti dopo ogni passaggio. Quindi lavare la cella di flusso con 2,5 millilitri di tampone BSA per rimuovere tutte le molecole di streptavidina libera.
Quindi, diluire il DNA lambda della biotina con motivi clonati usando il tampone BSA e iniettarlo quattro volte lentamente a intervalli di cinque minuti. Durante l'iniezione, accendere il microscopio nel sistema scientifico a semiconduttore a ossido di metallo gratuito. Quindi lavare il tubo con 10 millilitri di acqua doppia distillata e sciacquare il prisma e il connettore del tubo con acqua, il 2% di detergente per cuvette liquide e il 99% di etanolo.
Quindi, aspirare almeno 20 millilitri del tampone di imaging in una siringa da 30 millilitri. Impostare la cella di flusso sullo stadio del microscopio e collegarla al sistema microfluidico. Utilizzando una portata di 0,03 millilitri al minuto, lavare le molecole di DNA alla barriera per 10 minuti.
Quindi spegnere il sistema microfluidico e incubare per 30 minuti. con il flusso fermato, permettendo al DNA di diffondersi lateralmente. Per visualizzare la formazione di condensazione EWS-FLI1 sulle cortine di DNA, aprire il software di imaging e trovare e contrassegnare le posizioni dei nove modelli a zigzag sotto il campo luminoso.
Quindi accendere il flusso a 0,2 millilitri al minuto per macchiare il DNA con colorante DNA a doppio filamento per 10 minuti. Quindi, diluire la proteina mCherry EWS-FLI1 con il tampone di imaging a una concentrazione di 100 nanomoli in 100 microlitri. Quindi caricare il campione proteico attraverso la valvola con una siringa di vetro da 100 microlitri e modificare la portata a 0,4 millilitri al minuto.
Dopo aver acceso il laser a 488 nanometri, ogni regione per verificare lo stato di distribuzione del DNA e selezionare la regione in cui le molecole di DNA si distribuiscono uniformemente. Quindi impostare la potenza del laser al 10% per il laser a 488 nanometri e al 20% per il laser a 561 nanometri. E usando il misuratore di potenza, misurare la potenza reale del laser vicino al prisma.
Inizia ad acquisire immagini a intervalli di due secondi con laser a 488 e 561 nanometri contemporaneamente. Quindi cambiare la valvola dalla modalità manuale alla modalità di iniezione per consentire al tampone di imaging di lavare il campione proteico nella cella di flusso dopo 60 secondi. Per rimuovere l'EWS-FLI1 libero, continuare a lavare la cella di flusso con il buffer di imaging per cinque minuti con solo il laser a 561 nanometri acceso.
Quindi interrompere il flusso e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo 10 minuti, accendere il flusso a 0,4 millilitri al minuto per consentire al DNA di estendersi e acquisire immagini a intervalli di due secondi tra diversi fotogrammi per ottenere dati ad alta produttività della formazione di condensato EWS-FLI1. Le molecole di EWS-FLI1 sono state visualizzate rilevando i segnali EWS-FLI1 etichettati con mCherry ottenuti con un laser a 561 nanometri.
La formazione in vitro di condensato EWS-FLI1 nel sito delle 25 ripetizioni GGAA nel substrato del DNA potrebbe essere visualizzata direttamente. La specificità di mCherry EWS-FLI1 utilizzato nelle tende di DNA è stata confermata da un saggio di spostamento della mobilità elettroforetica utilizzando un modello di DNA con e senza le 25 ripetizioni GGAA separatamente. Quando la concentrazione di EWS-FLI1 è stata titolata da 20 a 500 nanomoli, l'intensità di EWS-FLI1 è aumentata drasticamente.
Mentre il cambiamento nell'intensità di FLI one DBD era trascurabile quando le proteine erano sature per coprire le ripetizioni GGAA, suggerendo che EWS-FLI1 formava condensati sul DNA. L'iniezione deve essere molto lenta e morbida in modo che il liposoma e il DNA possano distribuirsi uniformemente sulla cellula a flusso. È importante eseguire MSA per confermare che un fattore di trascrizione purificato si lega specificamente con la sequenza target in vitro.
Questa tecnica consente alle persone di esplorare se la condensa faciliterà la ricerca target dei fattori di trascrizione e il suo effetto sulla trascrizione.
