Nous fournissons un test à molécule unique pour observer la séparation de phase des facteurs de transcription sur l’ADN Cette technique permet la réalisation en temps réel du processus dynamique d’assemblage des facteurs de transcription sous forme de gouttelette liquide sur l’ADN. EWS-FL1 est l’un des gènes de fusion les plus fréquemment impliqués dans la tumorigenèse du sarcome d’Ewing. Notre recherche a pu identifier la relation entre le nombre de motifs d’ADN et la formation de condensat EWS-FL1 qui est associée à une transcription génique stérile dans les cellules tumorales, et peut-être utile pour le pronostic.
Cette méthode pourrait être appliquée pour étudier n’importe quel condensat ou complexe de transcription in vitro, comme P53 et MED1. Pour préparer une cellule d’écoulement avec des barrières nanofabriquées en zigzag pour une expérience de rideau d’ADN, connectez les tubes d’entrée et de sortie dans la bonne direction. Ensuite, lavez la cellule d’écoulement avec 2,5 millilitres de tampon lipidique à l’aide de deux seringues de trois millilitres, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulle dans la cellule d’écoulement.
Retirez la seringue de la sortie et injectez un millilitre de solution liposomique trois fois avec une incubation de cinq minutes entre chaque injection. Pour la guérison, relavez lentement la cellule d’écoulement avec 2,5 millilitres de tampon lipidique et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Pendant l’incubation, préparer le tampon BSA comme mentionné dans le manuscrit du texte.
Ensuite, après 30 minutes de guérison, lavez la cellule d’écoulement avec 2,5 millilitres de tampon BSA du côté de la sortie. Ensuite, injectez 800 microlitres de tampon de streptavidine dans la cellule d’écoulement du côté de l’entrée en deux étapes avec une incubation de 10 minutes après chaque étape. Ensuite, lavez la cellule d’écoulement avec 2,5 millilitres de tampon BSA pour éliminer toutes les molécules de streptavidine libres.
Ensuite, diluez l’ADN lambda de biotine avec des motifs clonés à l’aide d’un tampon BSA et injectez-le quatre fois lentement à intervalles de cinq minutes. Pendant l’injection, allumez le microscope dans le système scientifique complémentaire à semi-conducteur à oxyde métallique. Ensuite, lavez le tube avec 10 millilitres d’eau distillée double et rincez le prisme et le connecteur de tuyauterie avec de l’eau, un nettoyant cuvette liquide à 2% et de l’éthanol à 99%.
Ensuite, aspirez au moins 20 millilitres du tampon d’imagerie dans une seringue de 30 millilitres. Installez la cellule d’écoulement sur la platine du microscope et connectez-la au système microfluidique. En utilisant un débit de 0,03 millilitre par minute, rincer les molécules d’ADN à la barrière pendant 10 minutes.
Ensuite, éteignez le système microfluidique et incuber pendant 30 minutes. avec l’écoulement arrêté, permettant à l’ADN de diffuser latéralement. Pour imager la formation de condensation EWS-FLI1 sur des rideaux d’ADN, ouvrez le logiciel d’imagerie et recherchez et marquez les positions des neuf motifs en zigzag sous fond clair.
Ensuite, allumez le flux à 0,2 millilitre par minute pour colorer l’ADN avec un colorant ADN double brin pendant 10 minutes. Ensuite, diluez la protéine mCherry EWS-FLI1 avec le tampon d’imagerie à une concentration de 100 nanomoles dans 100 microlitres. Ensuite, chargez l’échantillon de protéines à travers la valve avec une seringue en verre de 100 microlitres et modifiez le débit à 0,4 millilitre par minute.
Après avoir allumé le laser de 488 nanomètres, pré-balayez chaque région pour vérifier l’état de distribution de l’ADN et sélectionner la région dans laquelle les molécules d’ADN se répartissent uniformément. Réglez ensuite la puissance laser sur 10% pour le laser 488 nanomètres et 20% pour le laser 561 nanomètres. Et à l’aide du capteur de puissance, mesurez la puissance réelle du laser près du prisme.
Commencez à acquérir des images à intervalles de deux secondes avec des lasers de 488 et 561 nanomètres simultanément. Ensuite, passez le mode manuel au mode injection pour laisser le tampon d’imagerie rincer l’échantillon de protéines dans la cellule d’écoulement après 60 secondes. Pour retirer l’EWS-FLI1 libre, continuez à laver la cellule d’écoulement avec le tampon d’imagerie pendant cinq minutes avec seulement le laser 561 nanomètres allumé.
Ensuite, arrêtez l’écoulement et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après 10 minutes, activez le débit à 0,4 millilitre par minute pour laisser l’ADN s’étendre et acquérir des images à deux secondes d’intervalle entre différentes images pour obtenir des données à haut débit de la formation de condensats EWS-FLI1. Les molécules EWS-FLI1 ont été visualisées en détectant les signaux EWS-FLI1 marqués mCherry obtenus avec un laser de 561 nanomètres.
La formation in vitro du condensat EWS-FLI1 sur le site des 25 répétitions GGAA dans le substrat d’ADN a pu être directement visualisée. La spécificité du mCherry EWS-FLI1 utilisé dans les rideaux d’ADN a été confirmée par un test de décalage de mobilité électrophorétique utilisant un modèle d’ADN avec et sans les 25 répétitions GGAA séparément. Lorsque la concentration d’EWS-FLI1 a été titrée de 20 à 500 nanomoles, l’intensité d’EWS-FLI1 a considérablement augmenté.
Alors que le changement dans l’intensité de la DBD d’un FLI était négligeable lorsque les protéines étaient saturées pour couvrir les répétitions GGAA, ce qui suggère que EWS-FLI1 a formé des condensats sur l’ADN. L’injection doit être très lente et douce afin que le liposome et l’ADN puissent se répartir uniformément sur la cellule d’écoulement. Il est important d’effectuer une MSA pour confirmer qu’un facteur de transcription purifié se lie spécifiquement à la séquence cible in vitro.
Cette technique permet aux gens d’explorer si le condensat facilitera la recherche cible des facteurs de transcription et son effet sur la transcription.
