العديد من مستضدات لقاح الوحدة الفرعية المرشحة هي بروتينات غشائية. تاريخيا ، كان من الصعب إنتاجها وتنقيتها بكميات كافية. باستخدام هذه التقنية، يمكننا تكوين مولدات ضد مهمة مضمنة داخل الغشاء الدهني للمساعدة في ضمان تأكيد يشبه الطبيعي.
تسهل هذه العملية أيضا الصياغة مع المواد المساعدة ذات الأهمية. يتيح التعبير الخالي من الخلايا الإنتاج السريع للبروتينات ذات الأهمية في بنيتها الأصلية الخالية من العلامات. هذه التقنية قابلة للتطوير أيضا ونحن نعمل بالفعل مع الشركات التجارية لتطوير تركيبات اللقاح باستخدام هذه العملية.
نوضح هنا عملية الكشف عن مولد ضد الكلاميديا، لكن يمكن تكييف العملية بسهولة لإنتاج مولدات الضد المهمة بغض النظر عما إذا كانت بروتينات غشائية أم لا. قد تكون هذه العملية قابلة للتطبيق على كل من تطوير لقاح مسببات الأمراض والسرطان. للبدء ، قم بإعداد MOMP-tNLPs باستخدام طريقة خالية من الخلايا.
قم بإذابة محلول إعادة التكوين من مجموعة تعبير البروتين الخالي من الخلايا قبل ساعتين من ضبط التفاعل وأضف مثبط الأنزيم البروتيني الخالي من EDTA إلى المخزن المؤقت. استخدم مجموعة مصممة لتشغيل خمسة تفاعلات سعة ملليلتر واحد. لكل تفاعل سعة ملليلتر واحد ، أضف 525 ميكرولترا من المخزن المؤقت لإعادة التكوين إلى زجاجة تحلل E.coli ولفها حتى تذوب.
أضف 250 ميكرولترا من المخزن المؤقت لإعادة التكوين إلى زجاجة التفاعل التي تحتوي على المادة المضافة وتذوب عن طريق التدحرج. بعد ذلك ، أضف 8.1 ملليلتر من المخزن المؤقت لإعادة التكوين إلى زجاجة تغذية التفاعل ولفها حتى تذوب. إلى زجاجة من خليط الأحماض الأمينية ، أضف ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت لإعادة التكوين لإذابته.
إلى زجاجة أخرى من الميثيونين ، أضف 1.8 ملليلتر من المخزن المؤقت لإعادة التكوين ، وقم بحله ، وقم بتخزينه على الجليد. أضف 225 ميكرولترا من الخليط المعاد تكوينه ، و 270 ميكرولترا من خليط الأحماض الأمينية المعاد تكوينه بدون ميثيونين ، و 30 ميكرولترا من الميثيونين المعاد تكوينه إلى زجاجة تحلل الإشريكية القولونية. علاوة على ذلك ، أضف 400 ميكرولتر من خليط DMPC / telodendrimer 15 ميكروغرام من بلازميد MOMP ، و 0.6 ميكروغرام من delta-49ApoA1 إلى الخليط واخلطه.
القسمة 20 ميكرولتر من المحلول الكلي في أنبوب 1.5 ملليلتر لتفاعل التحكم المعرب عن GFP. تحضير محلول تغذية عن طريق إضافة 2.65 ملليلتر من خليط الأحماض الأمينية المعاد تكوينه بدون ميثيونين و 300 ميكرولتر من الميثيونين المعاد تكوينه. انقل ملليلترا واحدا من محلول التفاعل إلى غرفة التفاعل الداخلية في مجموعة التفاعل الخالية من الخلايا وأغلقها.
املأ الغرفة الخارجية لوعاء التفاعل ب 10 ملليلتر من محلول التغذية وأغلقه. أضف 0.5 ميكرولتر من بلازميد التحكم GFP إلى حصص 20 ميكرولتر من خليط التفاعل. ضع التفاعل في شاكر عند 300 دورة في الدقيقة لمدة 18 ساعة عند 30 درجة سلزية.
راقب التفاعل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية بعد 15 دقيقة من أجل التألق بسبب تخليق GFP. قم بتنقية مركب الجسيمات النانوية MOMP-tNLP من خليط التفاعل الخالي من الخلايا عن طريق كروماتوغرافيا تقارب النيكل المجمدة باستخدام علامة HIS-على بروتين delta-49ApoA1. انقل ملليلترا واحدا من ملاط 50٪ من راتنج تنقية HIS-tag إلى عمود كروماتوغرافي يمكن التخلص منه سعة 10 ملليلتر ، وأضف ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت للربط لتحقيق التوازن.
بعد ذلك ، قم بتصريف المخزن المؤقت وإضافة 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط إلى الراتنج. استخراج 20 ميكرولتر من خليط التفاعل الخالي من الخلايا لتحليل SDS-PAGE. أضف خليط التفاعل الخالي من الخلايا المتبقي مع الراتنج المتوازن واحتضانه على هزاز المختبر لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية.
قم بإزالة غطاء العمود واغسله ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط. أضف سائل الغسيل إلى العمود واجمع التدفق من خلاله لتحليل SDS-PAGE. اغسل العمود بمليلتر واحد من المخزن المؤقت للغسيل مع 20 مليمول إيميدازول ست مرات واجمع الكسور.
أثناء الغسيل للمرة الثانية ، استخدم ماصة سعة ملليلتر واحد لتحريك الراتنج. تخلص من MOMP-tNLPs في ستة أجزاء سعة 300 ميكرولتر من محلول الشطف I الذي يحتوي على 250 مللي مولار إيميدازول وشطف نهائي مع 300 ميكرولتر من محلول الشطف II يحتوي على 500 مليمول إيميدازول. في الشطف الثاني ، حرك الراتنج بقوة عن طريق سحب الماصة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة ملليلتر واحد.
استخدم جهاز تصوير جل لالتقاط الصور بسرعة 600 نانومتر. بعد ذلك ، حدد كمية البروتينات المختلفة في الجسيمات النانوية من خلال تحليل SDS-PAGE باستخدام معيار البروتين. ارسم منحنى قياسيا باستخدام كثافات نطاقات MOMP.
ثم حدد مكون MOMP للجسيمات النانوية مع المعيار. حل العينات بواسطة SDS-PAGE ونقل مداخن الهلام باستخدام نظام نشاف جاف تجاري لتحليل البقع الغربية. قم بإزالة البقع من المكدس واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية في مخزن مؤقت مانع يحتوي على 0.2٪ TWEEN 20 و 0.5 ميكروغرام لكل مليلتر MAb40 ، أو 0.2 ميكروغرام لكل مليلتر MAbHIS antiHIS-tag الجسم المضاد الموجه ضد علامة HIS-من بروتين delta-49ApoA1.
اغسل كل لطخة باستخدام PBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل غسلة. احتضان البقع لمدة ساعة واحدة في مخزن مؤقت يحتوي على جسم مضاد ثانوي مقترن بفلوروفور بتخفيف 1:10،000. كرر الغسلات باستخدام PBST والتقط الصورة باستخدام جهاز تصوير مضان بعد الغسيل النهائي.
باستخدام جهاز لطخة نقطية ، لطخة ثلاثة ميكروغرام من MOMP-tNLP و tNLP فارغة. قم بتطوير ومنع البقع باستخدام نفس طريقة النشاف الغربي. قم بتجميد المحلول المختلط على الثلج الجاف وقم بتجفيفه بالتجميد طوال الليل باستخدام مجفف التجميد.
قم بتخزين التركيبات المجففة في درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. عند الحاجة ، أعد تكوين tNLPs المجففة بالتجميد بالماء الخالي من السموم الداخلية ولفها لتذوب وتعيد الترطيب. قم بغسيل المحلول باستخدام برنامج تلفزيوني وقم بإزالة التريهالوز باستخدام غشاء غسيل الكلى المقطوع 3.5 كيلو دالتون.
أجهزة الطرد المركزي محلول الجسيمات النانوية في مكثف فراغ قبل إضافة المساعد. راقب حجم العينة بعد 20 إلى 30 دقيقة لمنع التجفيف الكامل. في خزانة السلامة البيولوجية ، أضف المادة المساعدة في ظل ظروف معقمة.
باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي ، قم بتحليل صياغة الدمج الناجح. قم بتخزين MOMP-tNLPs المساعدة وإفراغ tNLP عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى 14 يوما. تحليل استقرار صيغة tNLP مع كروماتوغرافيا استبعاد الحجم.
تم إجراء تحليل SDS-PAGE ل MOMP-tNLP من خلال كروماتوغرافيا تقارب النيكل ، والتي أظهرت أن خليط التفاعل الخالي من الخلايا يحتوي على مستويات عالية من التعبير لكل من بروتينات MOMP و delta-49ApoA1. من خلال استخدام قياس كثافة الهلام ، تم تحديد تركيز MOMP باستخدام MOMP المنقى المؤتلف بتركيز معروف كمعيار. لتحديد تكوين oligomer ، تمت معالجة SDS-PAGE MOMP و MOMP-tNLP بالحرارة و DTT ، والتي أظهرت نطاقات مميزة ل MOMP و delta-49ApoA1.
تم استخدام تحليل اللطخة الغربية باستخدام الجسم المضاد MAb40 ضد بروتين MOMP ، والذي كشف عن نمط ربط يؤكد تكوين oligomer بواسطة بروتين MOMP في حالته غير المشوهة. تم إجراء فحص لطخة نقطية في وجود الأجسام المضادة MAb40 و MAbHIS ، والتي أشارت إلى تكوين MOMP-tNLP. ومع ذلك ، أظهر tNLP الفارغ إشارة إيجابية ل MAbHIS.
أظهرت الأمصال من الفئران المحصنة التي تم حقنها ب MOMP-tNLP المساعد ارتباطا قويا ب MOMP وأشارت إلى أن MOMP-tNLP يمكن أن تثير استجابة مناعية. نظرا لأن هذا البروتوكول يولد البروتين من الحمض النووي ، فمن الضروري تجنب تلويث التفاعل مع DNase و RNase ، وكذلك الحمض النووي الدخيل والحمض النووي الريبي. يجب أن تكون أي مواد أو كواشف مستخدمة في التفاعلات خالية من هذا النوع من الجزيئات.
بعد التعبير عن المواد المساعدة وتنقيتها وإضافتها ، يمكن تقييم هذه اللقاحات المرشحة في نماذج حيوانية مناسبة لمسببات الأمراض ذات الأهمية لتقييم علامات التنشيط المناعي أو تقييم الحماية أثناء التحدي. بالنسبة للكلاميديا ، يعتبر بروتين الغشاء الخارجي الرئيسي ، أو MOMP ، مستضدا مرشحا رئيسيا للقاحات الوحدات الفرعية لسنوات عديدة ، ولكن كان من الصعب إنتاجه على المستويات اللازمة لتطبيق اللقاح. يعد التعبير المشترك الخالي من الخلايا لهذا البروتين الغشائي طريقة قابلة للتطبيق لبدء تحريك هذا البروتين نحو التقييم في النماذج الحيوانية مثل الفئران ، وفي النهاية الدخول في الاختبارات البشرية.
