يهدف هذا البروتوكول إلى الحصول على أنواع خلايا عالية الجودة من الحمض النووي الريبي المحدد من عدد صغير من الخلايا في نسيج معقد دون فرز الخلايا. يستخدم نموذج فأر متاح مؤخرا يسمح للباحثين بعزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم باستخدام سحب GLP لأسفل. هذه الطريقة مناسبة أيضا لعزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم من أي خلايا تعبر عن EGFP.
للبدء ، أضف مليلتر من محلول عمل التجانس البارد إلى مجموعة مطحنة الأنسجة الزجاجية. ضع العينة المجمدة بسرعة في المطحنة وقم بتجانس الأنسجة ب 30 ضربة على الجليد باستخدام مدقة فضفاضة. نقل التجانس إلى أنبوب القاع المستدير 2 ملليلتر وأجهزة الطرد المركزي في 12،000 غرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.
ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد بسعة ملليلتر دون إزعاج الحبيبات ، مع الاحتفاظ ب 100 ميكرولتر كمدخل. احتضان المادة الطافية بالجسم المضاد ل GFP عند أربع درجات مئوية على دوار من طرف إلى طرف طوال الليل. انقل خليط التجانس والأجسام المضادة إلى أنبوب سفلي دائري جديد بسعة 2 ملليلتر يحتوي على حبات البروتين G المغسولة وحضن أربع درجات مئوية على الدوار عند 24 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين.
افصل الخرزات المغناطيسية عن الطافية باستخدام رف مغناطيسي. احفظ المادة الطافية في صورة الكسر السالب الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي في الخلايا السالبة EGFP والحمض النووي الريبي في الخلايا الموجبة EGFP غير المرتبطة بالريبوسومات. أضف ملليلتر واحد من محلول غسيل الملح العالي إلى الخرز ودوامة الأنبوب لفترة وجيزة لغسل الخرز.
ثم ضع الأنبوب في رف مغناطيسي. قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل وكرر خطوات الغسيل مرتين أخريين للحصول على مركب الحمض النووي الريبي الريبوسوم من الخلايا الإيجابية EGFP. احتضان الخرز ب 50 ميكرولتر من محلول الاستخراج من مجموعة عزل الحمض النووي الريبي في ThermoMixer لمدة 30 دقيقة لتحرير الحمض النووي الريبي من الخرز.
افصل الخرز برف مغناطيسي وانقل المادة الطافية إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. الطرد المركزي الأنبوب في 3000 غرام لمدة دقيقتين. ثم ماصة الطافية إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر.
لتكييف عمود تنقية الحمض النووي الريبي مسبقا ، ماصة 250 ميكرولتر من التكييف عازلة على عمود التنقية واحتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم الطرد المركزي العمود في 16،000 غرام لمدة دقيقة واحدة. ماصة حجم متساو من الإيثانول 70 ٪ في استخراج الخلية وتخلط جيدا عن طريق ماصة .
ماصة تصل إلى 200 ميكرولتر من الخليط في عمود تنقية الحمض النووي الريبي المشروط مسبقا. للحد من فقدان العينات لا تملأ العمود أكثر من 80٪ من سعته. كرر هذه الخطوة عدة مرات حتى يتم جمع جميع الحمض النووي الريبي في نفس العمود من كل كسر.
جهاز طرد مركزي للعمود لمدة دقيقتين لربط الحمض النووي الريبي بالغشاء الموجود في العمود. ثم استمر في الطرد المركزي لمدة 30 ثانية. تجاهل التدفق من خلال وماصة 100 ميكرولتر من غسل عازلة واحد في العمود.
جهاز طرد مركزي لمدة دقيقة واحدة ، ثم تخلص من التدفق من خلاله. ماصة 75 ميكرولتر من محلول الحمض النووي تخلط مباشرة في غشاء عمود التنقية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
ثم ، ماصة 40 ميكرولتر من غسل عازلة واحدة في العمود وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية أخرى. تجاهل التدفق من خلال. ماصة 100 ميكرولتر من العازلة غسل اثنين في العمود وأجهزة الطرد المركزي في 8،000 غرام لمدة دقيقة واحدة.
تجاهل التدفق من خلال. شراء PET 100 ميكرولتر من العازلة غسل اثنين في العمود وأجهزة الطرد المركزي في 16،000 غرام لمدة دقيقتين. تخلص من التدفق ، وأعد الطرد المركزي لنفس العمود عند 16،000 جم لمدة دقيقة واحدة لإزالة جميع آثار المخزن المؤقت للغسيل.
انقل العمود إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر. ماصة 12 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase مباشرة على غشاء عمود التنقية لضمان عدم لمس طرف الماصة للغشاء. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة وأجهزة الطرد المركزي في 1000 غرام لمدة دقيقة واحدة.
ثم في 16،000 غرام لمدة دقيقة واحدة لتقشير الحمض النووي الريبي. استخدم محلل حيوي لتقييم جودة وكمية الحمض النووي الريبي المستخرج. قم بتخزين الحمض النووي الريبي في فريزر 80 درجة أو أرسله لمزيد من التحليل.
الفئران التي تحمل كلا من الأليلات الجينية المعدلة وراثيا ، Gli1-CreERT2 و NuTRAP يتم حقننا بعقار تاموكسيفين مرة واحدة يوميا ، كل يومين لثلاث حقن. يظهر تحليل التألق المناعي للأنسجة المجمعة أنه تم التعبير عن EGFP في الخلايا الخلالية في الخصيتين. تم العثور على EGFP أيضا في خلايا المحفظة الكظرية في Gli1-CreERT2 ، الفئران NuTRAP.
في Sonic Hedgehog-CreERT2 ، فئران NuTRAP يتواجد عدد الخلايا الإيجابية EGFP في القشرة الخارجية للغدة الكظرية أسفل الكبسولة ، مما يؤكد التعبير عن خلايا التعبير المسبق EGFP. بعد استخراج الحمض النووي الريبي المحدد لنوع الخلية ، تم إرسال الحمض النووي الريبي المستخرج لتحليل microarray . أظهرت النتائج أنه تم إثراء حوالي 3000 جين في الجزء الموجب ، مقارنة بالجينات في الجزء السالب ، بينما تم إثراء حوالي 4000 جين في الجزء السالب.
من بين الجينات المعبر عنها التفاضلية ، تم إثراء الجينات المرتبطة بخلية Leydig Hsd11b1 و Hsd3b6 في الكسر الموجب. في الجزء السالب ، تم إثراء الجينات المرتبطة بخلية سيرتولي Desert Hedgehog و Gstm6. تم تحديد عدد قليل فقط من الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي في مقارنة الكسر السالب مع المدخلات.
تم استخدام RT-PCR الكمي في الوقت الفعلي لتأكيد التعبير عن الجينات الرئيسية في الكسور الموجبة والسالبة. على غرار ما تم العثور عليه في مقايسة microarray ، تم إثراء إنزيمات الستيرويد 3-beta hydroxy الستيرويد ديهيدروجينيز وإنزيم انشقاق السلسلة الجانبية للكوليسترول في الكسر الموجب. وفي الوقت نفسه ، تم إثراء عامل نسخ مربع SRY لعلامة خلية سيرتولي والبروتين المعقد المتشابك الثالث لعلامة الخلية الجرثومية في الكسر السالب.
عند محاولة هذا البروتوكول ، من المهم تحضير محلول عمل تجانس جديد أضف DTT وريبونوكلياز سيكلوهيكسيميد المؤتلف وكوكتيل مثبط البروتيناز إلى محلول مخزون التجانس فقط قبل الاستخدام. من المهم أيضا تحضير محلول ملح طازج منخفض ومخازن غسيل عالية الملح قبل الاستخدام.
