Este protocolo tiene como objetivo obtener ARN específicos de tipos celulares de alta calidad a partir de un pequeño número de células en un tejido complejo sin clasificación celular. Emplea un modelo de ratón recientemente disponible que permite a los investigadores aislar un ARN unido a ribosomas utilizando GLP pull down. El método también es adecuado para aislar ARN unidos a ribosomas de cualquier célula que exprese EGFP.
Para comenzar, agregue dos mililitros de tampón de trabajo de homogeneización helada a un juego de molinillo de papel de vidrio. Coloque rápidamente la muestra congelada en el molinillo y homogeneice el tejido con 30 golpes en hielo con un mortero suelto. transfiera el homogeneizado a un tubo inferior redondo de dos mililitros y centrifugar a 12, 000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Luego transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de dos mililitros sin alterar el pellet, reservando 100 microlitros como entrada. Incubar el sobrenadante con el anticuerpo anti-GFP a cuatro grados centígrados en un rotador de extremo a extremo durante la noche. Transfiera la mezcla de homogeneización y anticuerpos a un nuevo tubo inferior redondo de dos mililitros que contenga perlas de proteína g lavadas e incube cuatro grados centígrados en el rotador a 24 RPM durante dos horas.
Separe las perlas magnéticas del sobrenadante utilizando una rejilla magnética. Guarde el sobrenadante como la fracción negativa que contiene los ARN en las células negativas de EGFP y los ARN en las células positivas de EGFP que no están unidas a los ribosomas. Agregue un mililitro de tampón de lavado con alto contenido de sal a las perlas y vorete brevemente el tubo para lavar las perlas.
Luego coloque el tubo en una rejilla magnética. Retire el tampón de lavado y repita los pasos de lavado dos veces más para obtener el complejo de ARN ribosómico de las perlas de las células positivas para EGFP. Incubar las perlas con 50 microlitros de tampón de extracción del kit de aislamiento de ARN en un ThermoMixer durante 30 minutos para liberar ARN de las perlas.
Separe las perlas con una rejilla magnética y transfiera el sobrenadante a un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo a 3000 g durante dos minutos. A continuación, pipetear el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros.
Para acondicionar previamente la columna de purificación de ARN, pipetear 250 microlitros de tampón de acondicionamiento en la columna de purificación e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego centrifugar la columna a 16, 000 g durante un minuto. Pipetear un volumen igual de etanol al 70% en el extracto celular y mezclar bien mediante pipeteo.
Pipetear hasta 200 microlitros de la mezcla en la columna de purificación de ARN preacondicionada. Para reducir la pérdida de muestras no llene la columna más del 80% de su capacidad. Repita este paso varias veces hasta que todos los ARN se recojan en la misma columna de cada fracción.
Centrifugar la columna durante dos minutos para unir el ARN a la membrana de la columna. Luego continúe la centrifugación durante 30 segundos. Deseche el flujo a través y pipete 100 microlitros de tampón de lavado uno en la columna.
Centrifugar durante un minuto, luego desechar el flujo a través. La pipeta 75 microlitros de solución de ADN se mezcla directamente en la membrana de la columna de purificación. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Luego, pipetear 40 microlitros de tampón de lavado uno en la columna y centrifugar durante otros 30 segundos. Deseche el flujo a través. Pipetear 100 microlitros de tampón de lavado dos en la columna y centrifugar a 8, 000 g durante un minuto.
Deseche el flujo a través. Compre PET 100 microlitros de tampón de lavado dos en la columna y centrifugar a 16, 000 g durante dos minutos. Deseche el flujo y vuelva a centrifugar la misma columna a 16, 000 g durante un minuto para eliminar todos los restos de tampón de lavado.
Transfiera la columna a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. pipetear 12 microlitros de agua libre de RNasa directamente sobre la membrana de la columna de purificación asegurando que la punta de la pipeta no toque la membrana. Incubar a temperatura ambiente durante un minuto y centrifugar a 1000 g durante un minuto.
Luego, a 16, 000 G durante un minuto para eluyir el ARN. Utilice un bioanalizador para evaluar la calidad y cantidad del ARN extraído. Almacene los ARN en un congelador de 80 grados o envíelos para su posterior análisis.
Ratones portadores de alelos genéticos genéticamente modificados, Gli1-CreERT2 y NuTRAP se nos inyecta tamoxifeno una vez al día, cada dos días para tres inyecciones. El análisis de inmunofluorescencia de los tejidos recolectados muestra que el EGFP se expresó en células intersticiales en los testículos. EGFP también se encontró en células capsulares suprarrenales en ratones Gli1-CreERT2, NuTRAP.
En Sonic Hedgehog-CreERT2, ratones NuTRAP La población celular positiva de EGFP reside en la corteza externa de la glándula suprarrenal debajo de la cápsula, confirmando la expresión de células que expresan previamente EGFP. Después de la extracción de los ARN específicos del tipo de célula, el ARN extraído se envió para el análisis de microarrays. Los resultados mostraron que alrededor de 3000 genes se enriquecieron en la fracción positiva, en comparación con los genes en la fracción negativa, mientras que alrededor de 4.000 genes se enriquecieron en la fracción negativa.
Entre los genes diferenciales expresados, los genes asociados a células de Leydig Hsd11b1 y Hsd3b6 se enriquecieron en la fracción positiva. En la fracción negativa, se enriquecieron los genes asociados a las células de Sertoli Desert Hedgehog y Gstm6. Solo se identificaron unos pocos genes expresados diferencialmente al comparar la fracción negativa con la entrada.
Se utilizó RT-PCR cuantitativa en tiempo real para confirmar la expresión de genes clave en las fracciones positiva y negativa. Similar a lo que se encontró en el ensayo de microarrays, las enzimas esteroidogénicas 3-beta hidroxi esteroide deshidrogenasa y la enzima de escisión de la cadena lateral del colesterol se enriquecieron en la fracción positiva. Mientras tanto, el marcador celular de Sertoli SRY box factor de transcripción nueve y el marcador de células germinales sinaptonemal proteína tres del complejo se enriquecieron en la fracción negativa.
Al intentar este protocolo, es importante preparar un nuevo tampón de trabajo de homogeneización Agregue DTT, ribonucleasa recombinante de cicloheximida y cóctel de inhibidores de proteinasa a la solución madre de homogeneización solo antes de usar. También es importante preparar tampones frescos bajos en sal y los tampones de lavado con alto contenido de sal antes de su uso.
