Bu protokol, hücre sıralaması olmadan karmaşık bir dokudaki az sayıda hücreden yüksek kaliteli hücre tiplerine özgü RNA'lar elde etmeyi amaçlamaktadır. Araştırmacıların GLP pull down kullanarak ribozom bağlı RNA'ları izole etmelerini sağlayan yakın zamanda mevcut bir fare modeli kullanıyor. Yöntem ayrıca, ribozom bağlı RNA'ları herhangi bir EGFP eksprese eden hücreden izole etmek için de uygundur.
Başlamak için, bir cam doku öğütücü setine iki mililitre buz gibi soğuk homojenizasyon çalışma tamponu ekleyin. Dondurulmuş numuneyi hızlı bir şekilde öğütücüye yerleştirin ve gevşek bir havane kullanarak dokuyu buz üzerinde 30 vuruşla homojenleştirin. homojenatı iki mililitrelik yuvarlak bir alt boruya aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 12.000 g'da santrifüj yapın.
Daha sonra süpernatantı peleti rahatsız etmeden iki mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve giriş olarak 100 mikrolitre ayırın. Süpernatantı anti-GFP antikoru ile bir uçtan uca rotatörde dört santigrat derecede bir gecede inkübe edin. Homojenat ve antikor karışımını, yıkanmış protein g boncukları içeren yeni bir iki mililitrelik yuvarlak alt tüpe aktarın ve iki saat boyunca 24 RPM'de rotatörde dört santigrat derece inkübe edin.
Manyetik bir raf kullanarak manyetik boncukları süpernatanttan ayırın. Süpernatantı EGFP negatif hücrelerindeki RNA'ları ve ribozomlara bağlı olmayan EGFP pozitif hücrelerdeki RNA'ları içeren negatif fraksiyon olarak kaydedin. Boncuklara bir mililitre yüksek tuzlu yıkama tamponu ekleyin ve boncukları yıkamak için tüpü kısaca vorteksleyin.
Ardından tüpü manyetik bir rafa yerleştirin. Yıkama tamponunu çıkarın ve boncuk ribozom RNA kompleksini EGFP pozitif hücrelerden elde etmek için yıkama adımlarını iki kez daha tekrarlayın. RNA'ları boncuklardan serbest bırakmak için boncukları bir ThermoMixer'daki RNA izolasyon kitinden 50 mikrolitre ekstraksiyon tamponu ile 30 dakika boyunca inkübe edin.
Boncukları manyetik bir rafla ayırın ve süpernatantı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü iki dakika boyunca 3000 g'da santrifüj yapın. Ardından süpernatantı yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe pipetleyin.
RNA saflaştırma kolonunu ön koşullandırmak için, saflaştırma kolonuna 250 mikrolitre şartlandırma tamponu pipetleyin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra sütunu bir dakika boyunca 16.000 g'da santrifüj edin. Hücre ekstraktına eşit hacimde% 70 etanol pipetleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın.
Önceden koşullandırılmış RNA saflaştırma kolonuna 200 mikrolitreye kadar pipet. Numune kaybını azaltmak için kolonu, kapasitesinin% 80'inden fazlasını doldurmayın. Tüm RNA'lar her fraksiyonun aynı sütununda toplanana kadar bu adımı birkaç kez tekrarlayın.
RNA'yı kolondaki zara bağlamak için sütunu iki dakika boyunca santrifüj edin. Ardından 30 saniye boyunca santrifüjlemeye devam edin. Akış akışını atın ve pipetteki 100 mikrolitre yıkama tamponunu bir tanesi kolona atın.
Bir dakika boyunca santrifüj yapın, ardından akışı atın. Pipet 75 mikrolitre DNA çözeltisi doğrudan arıtma kolon membranına karışır. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
Daha sonra, pipet 40 mikrolitre yıkama tamponunu bir kolona yerleştirir ve 30 saniye daha santrifüj yapar. Akışı atın. Pipet 100 mikrolitre yıkama tamponunu iki kolona yerleştirin ve bir dakika boyunca 8.000 g'da santrifüj yapın.
Akışı atın. PET 100 mikrolitre yıkama tamponunu kolona iki kez satın alın ve iki dakika boyunca 16.000 g'da santrifüj yapın. Akışı atın ve tüm yıkama tamponu izlerini gidermek için aynı sütunu bir dakika boyunca 16.000 g'da yeniden santrifüj yapın.
Kolonu yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. pipet 12 mikrolitre RNaz içermeyen su doğrudan arıtma kolonunun membranına pirinç ucunun membrana temas etmemesini sağlar. Bir dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve bir dakika boyunca 1000 g'da santrifüj yapın.
Daha sonra RNA'yı etkisiz hale getirmek için bir dakika boyunca 16.000 G'de. Ekstrakte edilen RNA'nın kalitesini ve miktarını değerlendirmek için bir biyoanalizör kullanın. RNA'ları 80 derecelik bir dondurucuda saklayın veya daha fazla analiz için gönderin.
Hem genetiği değiştirilmiş gen alelleri, Gli1-CreERT2 hem de NuTRAP taşıyan farelere, günde bir kez, her gün üç enjeksiyon için tamoksifen enjekte edilir. Toplanan dokuların immünofloresan analizi, EGFP'nin testislerdeki interstisyel hücrelerde eksprese edildiğini göstermektedir. EGFP ayrıca Gli1-CreERT2, NuTRAP farelerde adrenal kapsüler hücrelerde bulundu.
Sonic Hedgehog-CreERT2'de, NuTRAP fareleri EGFP pozitif hücre popülasyonu, kapsülün altındaki adrenal bezin dış korteksinde bulunur ve EGFP ön eksprese eden hücrelerin ekspresyonunu doğrular. Hücre tipine özgü RNA'ların ekstraksiyonundan sonra, ekstrakte edilen RNA mikroarray analizi için gönderildi. Sonuçlar, negatif fraksiyondaki genlere kıyasla, pozitif fraksiyonda yaklaşık 3000 genin zenginleştirildiğini, oysa negatif fraksiyonda yaklaşık 4.000 genin zenginleştirildiğini göstermiştir.
Diferansiyel eksprese genler arasında, Leydig hücresi ile ilişkili genler Hsd11b1 ve Hsd3b6 pozitif fraksiyonda zenginleştirildi. Negatif fraksiyonda, Sertoli hücresi ile ilişkili genler Desert Hedgehog ve Gstm6 zenginleştirildi. Negatif fraksiyonun girdi ile karşılaştırılmasında sadece birkaç farklı şekilde eksprese edilen gen tanımlanmıştır.
Pozitif ve negatif fraksiyonlardaki anahtar genlerin ekspresyonunu doğrulamak için gerçek zamanlı kantitatif RT-PCR kullanıldı. Mikroarray testinde bulunanlara benzer şekilde, steroidojenik enzimler 3-beta hidroksi steroid dehidrogenaz ve kolesterol yan zincir bölünme enzimi pozitif fraksiyonda zenginleştirildi. Bu arada, Sertoli hücre belirteci SRY kutusu transkripsiyon faktörü dokuz ve germ hücre belirteci sinaptonemal kompleks protein üçü negatif fraksiyonda zenginleştirildi.
Bu protokolü denerken, taze homojenizasyon çalışma tamponu hazırlamak önemlidir DTT, sikloheksimid rekombinant ribonükleaz ve proteinaz inhibitörü kokteylini homojenizasyon stok çözeltisine sadece kullanımdan önce ekleyin. Kullanmadan önce taze düşük tuz ve yüksek tuzlu yıkama tamponlarının hazırlanması da önemlidir.
