פרוטוקול זה נועד להשיג רנ"א ספציפיים מסוגי תאים באיכות גבוהה ממספר קטן של תאים ברקמה מורכבת ללא מיון תאים. הוא משתמש במודל עכברים זמין לאחרונה המאפשר לחוקרים לבודד רנ"א הקשור לריבוזום באמצעות משיכת GLP כלפי מטה. השיטה מתאימה גם לבידוד רנ"א הקשור לריבוזום מכל תא EGFP המבטא.
כדי להתחיל, הוסף שני מיליליטר של הומוגניזציה קרה כקרח חיץ עבודה לסט מטחנת רקמת זכוכית. הכנס במהירות את הדגימה הקפואה לתוך המטחנה והומוגני את הרקמה עם 30 משיכות על קרח באמצעות מזיק רופף. להעביר את homogenate לצינור תחתון עגול שני מיליליטר צנטריפוגה ב 12, 000 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן העבירו את הסופרנאטנט לצינור חדש של שני מיליליטר מבלי להפריע לכדור, תוך שמירת 100 מיקרוליטרים כקלט. לדגום את הסופרנטנט עם הנוגדן נגד GFP בארבע מעלות צלזיוס על קצה מעל הקצה מסובב לילה. מעבירים את תערובת ההומוגנט והנוגדנים לצינור תחתון עגול חדש של שני מיליליטר המכיל חרוזי חלבון שטופים ודגירה של ארבע מעלות צלזיוס על סיבוב ב-24 סל"ד למשך שעתיים.
הפרידו את החרוזים המגנטיים מהסופר-נטנט באמצעות מתלה מגנטי. שמור את הסופרנטנט כשבר השלילי המכיל את הרנ"א בתאים שליליים של EGFP ואת הרנ"א בתאים חיוביים של EGFP שאינם קשורים לריבוזומים. מוסיפים מיליליטר אחד של מלח גבוה לשטוף את החרוזים ומערבבים לזמן קצר את הצינור כדי לשטוף את החרוזים.
לאחר מכן הניחו את הצינור במדף מגנטי. הסר את חיץ הכביסה וחזור על שלבי הכביסה פעמיים נוספות כדי לקבל את קומפלקס RNA ריבוזום חרוזים מתאים חיוביים EGFP. דגרו את החרוזים עם 50 מיקרוליטרים של חיץ מיצוי מתוך ערכת בידוד הרנ"א ב-ThermoMixer למשך 30 דקות כדי לשחרר רנ"א מהחרוזים.
מפרידים את החרוזים עם מתלה מגנטי ומעבירים את הסופרנטנט לצינור של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור ב 3000 גרם במשך שתי דקות. לאחר מכן פיפטה את supernatant לצינור חדש 1.5 מיליליטר.
כדי להתנות מראש את עמודת טיהור ה-RNA, פיפטה 250 מיקרוליטרים של חיץ התניה על עמודת הטיהור ודגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. ואז צנטריפוגה את הטור ב 16, 000 גרם במשך דקה אחת. מכניסים נפח שווה של 70% אתנול לתוך תמצית התא ומערבבים היטב על ידי פיפטה.
פיפטה עד 200 מיקרוליטר של התערובת לתוך עמודת טיהור RNA מותנה מראש. כדי להפחית את אובדן הדגימות לא למלא את העמודה יותר מ 80% של קיבולת שלה. חזור על שלב זה מספר פעמים עד שכל הרנ"א נאספים באותה עמודה של כל שבר.
צנטריפוגה של העמודה במשך שתי דקות כדי לקשור RNA לממברנה בעמודה. לאחר מכן המשך צנטריפוגה במשך 30 שניות. השליכו את הזרימה דרך פיפטה 100 מיקרוליטר של חיץ כביסה אחד לתוך העמודה.
צנטריפוגה במשך דקה אחת, ולאחר מכן להשליך את הזרימה דרך. פיפטה 75 מיקרוליטר של תמיסת DNA מתערבבים ישירות לתוך קרום עמודת הטיהור. לדגור בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
לאחר מכן, פיפטה 40 מיקרוליטר של לשטוף חיץ אחד לתוך העמודה צנטריפוגה במשך 30 שניות נוספות. השלך את הזרימה דרך. פיפטה 100 מיקרוליטר של חיץ לשטוף שניים לתוך העמוד צנטריפוגה ב 8, 000 גרם במשך דקה אחת.
השלך את הזרימה דרך. קנה PET 100 microliters של חיץ לשטוף שני לתוך העמודה צנטריפוגה ב 16, 000 גרם במשך שתי דקות. השלך את הזרימה דרך, וצנטריפוגה מחדש את אותו עמוד ב 16, 000 גרם למשך דקה אחת כדי להסיר את כל עקבות של חיץ לשטוף.
העבר את העמודה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר. פיפטה 12 מיקרוליטר של מים ללא RNase ישירות על הממברנה של עמודת הטיהור המבטיחה כי קצה הפיפטה אינו נוגע בממברנה. דגירה בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת וצנטריפוגה ב 1000 גרם במשך דקה אחת.
ואז ב 16, 000 G במשך דקה אחת כדי לרומם את ה- RNA. השתמש בביואנליזה כדי להעריך את האיכות והכמות של הרנ"א המופק. אחסנו את הרנ"א במקפיא של 80 מעלות או שלחו לניתוח נוסף.
עכברים הנושאים את שני אללי הגנים המהונדסים גנטית, Gli1-CreERT2 ו-NuTRAP מוזרק לנו טמוקסיפן פעם ביום, אחת ליומיים לשלוש זריקות. ניתוח אימונופלואורסצנטי של רקמות שנאספו מראה כי ה- EGFP התבטא בתאים אינטרסטיציאליים באשכים. EGFP נמצא גם בתאים קפסולריים של יותרת הכליה בעכברי Gli1-CreERT2, NuTRAP.
ב- Sonic Hedgehog-CreERT2, עכברי NuTRAP אוכלוסיית התאים החיוביים של EGFP שוכנת בקליפת המוח החיצונית של בלוטת יותרת הכליה מתחת לקפסולה, המאשרת את הביטוי של תאי EGFP המבטאים מראש. לאחר מיצוי הרנ"א הספציפי לסוג התא, נשלח הרנ"א שחולץ לניתוח מיקרו-מערך. התוצאות הראו כי כ -3000 גנים היו מועשרים בחלק החיובי, לעומת גנים בחלק השלילי, ואילו כ -4, 000 גנים היו מועשרים בחלק השלילי.
מבין הגנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי, הגנים הקשורים לתאי Leydig Hsd11b1 ו-Hsd3b6 הועשרו בחלק החיובי. בחלק השלילי הועשרו הגנים הקשורים לתאי סרטולי קיפוד המדבר ו-Gstm6. רק גנים מעטים שהתבטאו באופן דיפרנציאלי זוהו בהשוואת החלק השלילי עם הקלט.
RT-PCR כמותי בזמן אמת שימש כדי לאשר את הביטוי של גנים מרכזיים בשברים חיוביים ושליליים. בדומה למה שנמצא בבדיקת המיקרו-אריי, הועשרו במקטע החיובי אנזימים סטרואידים 3-beta הידרוקסי דהידרוגנאז ואנזים ביקוע שרשרת הצד של הכולסטרול. בינתיים, סמן התא סרטולי SRY תיבת שעתוק פקטור תשע ואת סמן תא הנבט סינפטונמלי קומפלקס חלבון שלוש הועשרו בחלק השלילי.
כאשר מנסים פרוטוקול זה, חשוב להכין חיץ עבודה של הומוגניזציה טרייה הוסף DTT, ציקלוהקסמיד ריבונוקלאז רקומביננטי, וקוקטייל מעכב פרוטאינאז לתמיסת מלאי ההומוגניזציה רק לפני השימוש. חשוב גם להכין מלח דל מלח טרי ואת מאגרי שטיפת המלח הגבוהים לפני השימוש.
