تتطلب دراسة خصائص القناة الأيونية الأصلية باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية المشبك الرقعة الوصول إلى الخلايا المعزولة بشكل حاد. يصف هذا البروتوكول طرق الوصول إلى الخلايا العضلية القلبية الوعائية الفردية من أسماك الزرد في مختلف الأعمار. هذا البروتوكول قوي وبسيط وقابل للتكرار بسهولة ، ويعزل الخلايا العضلية القلبية الوعائية عن أسماك الزرد في حالتها الأصلية مع غلة عالية نسبيا وقابلية للحياة.
للبدء ، انقل السمك إلى طبق بتري كبير مملوء جزئيا بمخزن مؤقت للتروية وضعه تحت مجهر تشريح. امسك السمكة في اليد غير المهيمنة مع الجانب البطني الذي يواجه نطاق التشريح. باستخدام الملقط الناعم في اليد المهيمنة ، قم بتمزيق العضلات الصدرية وزعانف الأسماك بلطف للكشف عن أنسجة القلب والأوعية الدموية بما في ذلك الأذين والبطين والشرايين البصلعة.
اسحب الشرايين البصيلة برفق عند الطرف المتقاطع للشريان البصلي والشريان الأورطي البطني. افصل بعناية الشريان البصلي عن الشريان الأورطي عن طريق قرص الملقط ، وتحديد موقع طرف الأذين في الفروع الوريدية المتعددة التي تتقارب. ثم ، انتزع طرف الأذين من الجيوب الأنفية الوريدية لعزل أنسجة القلب والأوعية الدموية عن بقية الجسم.
لتشريح الخلايا العضلية القلبية ، انتزع الأذين والبطين من أنسجة القلب والأوعية الدموية. قم بعمل تمزق لطيف في البطين باستخدام ملقط ناعم لتصريف الدم الزائد ، والذي يمكن ضمانه عندما يتحول نسيج القلب من اللون الأحمر الفاتح إلى لون السلمون الشاحب. قم بتجميع الأذين والبطين المعزولين في أنبوب طرد مركزي منفصل سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على مخزن مؤقت للتروية.
استبدل المخزن المؤقت للتروية في الأنابيب ب 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت للهضم. ضع الأنابيب على شاكر حراري عند 37 درجة مئوية و 800 دورة في الدقيقة. اسمح بهضم الأنسجة حتى تصبح شفافة.
قم بإنهاء عملية الهضم عن طريق تدوير الأنسجة بلطف في جهاز طرد مركزي صغير على مقاعد البدلاء بسرعة 2،000 مرة G لمدة ثلاث إلى خمس ثوان واستبدل مخزن الهضم الفائق ب 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتوقف. استبدل المخزن المؤقت للتوقف بلطف ب 500 إلى 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتروية وقم بتقطيع الأنسجة 30 مرة باستخدام ماصة باستور مصقولة باللهب لتفريق الخلايا. ثم، قم بتعديل البطينين بلطف.
للحصول على عينات موحدة ، قم بماصة الخلايا بلطف لأعلى ولأسفل عدة مرات للإنعاش ، قبل إضافة قطرة منها للدراسات المقابلة. انتزع البصيلات الشريانية البالغة من أنسجة القلب والأوعية الدموية وتجمع خمسة بصيلات شريانية في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على عازل S1. استبدل S1 ب 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت S2 واسمح بهضم غراء البصيلات الشريانية على شاكر حراري عند 37 درجة مئوية و 800 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة.
اسمح للشريان البصلي المهضوم جزئيا بالاستقرار لمدة دقيقة واحدة واستبدل السوبرناتانت S2 ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت S3 الذي يحتوي على الكولاجيناز. هضم الأنسجة على شاكر حراري عند 37 درجة مئوية و 800 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. قم بإنهاء عملية الهضم عن طريق تدوير الأنسجة بلطف في جهاز طرد مركزي صغير على مقاعد البدلاء بسرعة 2000 مرة G لمدة ثلاث إلى خمس ثوان ، واستبدل S3 supernatant ب 500 ميكرولتر من S1. قم بتثلث الأنسجة الحبيبية بلطف لتفريق خلايا العضلات الملساء الوعائية.
لوحة خلايا العضلات الملساء الوعائية المنتشرة على زلات الغطاء الزجاجي ذات الحجم المناسب. احتفظ بانزلاقات الغطاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة حتى تعلق الخلايا ، واستخدمها خلال الساعات الست التالية. تخدير الأجنة.
ثم ركز الأجنة عن طريق نقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة خمسة ملليلترات ، ثم أزل الوسائط الزائدة. اغسل الأجنة بثلاثة ملليلترات من مخزن التروية البارد مرتين ، ثم أعد تعليقها في ملليلتر من مخزن التروية المؤقت. باستخدام جهاز عزل القلب الجنيني ، اسحب ملليلتر واحد من الأجنة إلى الإبرة وطردها على الفور مرة أخرى إلى الأنبوب.
مرر الأجنة المجزأة من خلال غربال مصفاة خلية 100 ميكرومتر موضوعة في قمع. اجمع القلوب المصفاة في أنبوب طرد مركزي آخر سعة خمسة ملليلترات. امزج الترشيح جيدا وافصل أليكوت سعة ملليلتر واحد في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر.
قم بطرد جميع الأنابيب الموجودة على جهاز طرد مركزي صغير على مقاعد البدلاء لمدة خمس ثوان وتخلص من جهاز الطرد المركزي الفائق. قم بإجراء إعادة تعليق تسلسلي للكريات في الأنابيب باستخدام ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للتروية. ماصة بلطف القلوب صعودا وهبوطا مرتين قبل إضافة قطرة للدراسات المقابلة بالنسبة للخلايا المعزولة من البصيلات الشريانية ، تم تأكيد خلايا العضلات الملساء الوعائية بواسطة tagln:EGFP التعبير.
تظهر هنا آثار تمثيلية لتسجيلات نشاط قناة البوتاسيوم الحساسة ل ATP من الخلايا العضلية القلبية المعزولة. تم الحصول على تسجيلات ناجحة أحادية القناة في بقع تم استئصالها من القلوب الجنينية. أظهرت الخلايا العضلية البطينية إمكانات غشاء مفرطة الاستقطاب مستقرة ، وتم تحفيز إمكانات العمل عن طريق الحقن الحالي من خلال ماصة التصحيح.
أظهرت الخلايا العضلية الأذينية إطلاق نار محتمل عفوي. يتم تلخيص خصائص العمل المحتملة هنا. أثناء استبدال المخازن المؤقتة أثناء تفكك الخلايا العضلية القلبية ، يجب توخي الحذر من عدم إزعاج الأنسجة الهضمية.
يجب أن يتم تفتيت الأنسجة فقط عن طريق تريتوريون الماصة. أثناء هضم الكولاجين لأنسجة البصيل، افحص الأنسجة العائمة والموسعة والشفافة كل دقيقة. بمجرد ظهور تجزئة الأنسجة ، توقف عن الهضم.
بمجرد عزل الخلايا ، يمكن الاحتفاظ بها على قيد الحياة لساعات واستخدامها للتحليل الكهروفسيولوجي باستخدام تقنيات مشبك التصحيح. وقد سمح لنا هذا ، على سبيل المثال ، بإظهار أن قنوات البوتاسيوم الحساسة ل ATP في أنسجة أسماك الزرد هذه متطابقة بشكل أساسي مع تلك الموجودة في الثدييات.
