El estudio de las propiedades nativas del canal iónico utilizando la electrofisiología de la pinza de parche requiere acceso a células agudamente aisladas. Este protocolo describe métodos para acceder a miocitos cardiovasculares individuales del pez cebra a diferentes edades. Este protocolo es robusto, simple, fácilmente reproducible y aísla los miocitos cardiovasculares del pez cebra en su estado nativo con un rendimiento y viabilidad relativamente altos.
Para comenzar, transfiera el pescado a una placa de Petri grande parcialmente llena de tampón de perfusión y colóquelo bajo un microscopio de disección. Sostenga el pez en la mano no dominante con el lado ventral hacia el alcance de disección. Con los fórceps finos en la mano dominante, abra suavemente los músculos pectorales y las aletas de los peces para revelar los tejidos cardiovasculares, incluida la aurícula, el ventrículo y el bulbo arterioso.
Tire suavemente del bulbo arterioso en la punta de intersección del bulbo arterioso y la aorta ventral. Separe cuidadosamente el bulbo arterioso de la aorta pellizcando los fórceps, ubicando la punta de la aurícula en las múltiples ramas venosas que convergen. Luego, arranca la punta de la aurícula del seno venoso para aislar los tejidos cardiovasculares del resto del cuerpo.
Para diseccionar los cardiomiocitos, arrancar la aurícula y el ventrículo del tejido cardiovascular. Haga un desgarro suave en el ventrículo usando fórceps finos para drenar el exceso de sangre, lo que se puede garantizar cuando el tejido cardíaco cambia de rojo brillante a un color salmón pálido. Agrupe la aurícula y el ventrículo aislados en un tubo centrífugo separado de 1,5 mililitros que contenga tampón de perfusión.
Reemplace el tampón de perfusión en los tubos con 750 microlitros de tampón de digestión. Coloque los tubos en un termoagitador a 37 grados centígrados y 800 revoluciones por minuto. Permitir la digestión de los tejidos hasta que se vuelvan translúcidos.
Termine la digestión girando suavemente los tejidos en una minicentrífuga de sobremesa a 2, 000 veces G durante tres a cinco segundos y reemplace el tampón de digestión sobrenadante con 750 microlitros de tampón de parada. Reemplace suavemente el tampón de parada con 500 a 750 microlitros de tampón de perfusión y triture los tejidos 30 veces con una pipeta Pasteur pulida a la llama para dispersar las células. Luego, triture suavemente los ventrículos.
Para un muestreo uniforme, pipetear suavemente las células hacia arriba y hacia abajo un par de veces para resuspenderlas, antes de agregar una gota de ellas para los estudios correspondientes. Arrancar el bulbo arterioso adulto de los tejidos cardiovasculares y agrupar cinco bulbos arteriosos en un tubo centrífugo de 1,5 mililitros que contenga tampón S1. Reemplace S1 con 400 microlitros de tampón S2 y permita la digestión de la papaína del bulbo arterioso en un termoagitador a 37 grados centígrados y 800 revoluciones por minuto durante 20 minutos.
Deje que el bulbo arterioso parcialmente digerido se asiente durante un minuto y reemplace el sobrenadante S2 con 500 microlitros de tampón S3 que contiene colagenasa. Digiera los tejidos en un termoagitador a 37 grados centígrados y 800 revoluciones por minuto durante tres a cinco minutos. Termine la digestión girando suavemente los tejidos en una minicentrífuga de sobremesa a 2, 000 veces G durante tres a cinco segundos, y reemplace el sobrenadante S3 con 500 microlitros de S1. Triture suavemente los tejidos granulados para dispersar las células del músculo liso vascular.
La placa dispersa las células del músculo liso vascular sobre cubreobjetos de cubierta de vidrio de tamaño apropiado. Mantenga los cubreobjetos a temperatura ambiente durante 30 minutos para que las células se adhieran y úselos dentro de las próximas seis horas. Anestesiar los embriones.
Luego, concentre los embriones transfiriéndolos a un tubo de centrífuga de cinco mililitros, luego elimine el exceso de medios. Lave los embriones con tres mililitros de tampón de perfusión fría dos veces, luego vuelva a suspenderlos en dos mililitros de tampón de perfusión. Usando el aparato de aislamiento cardíaco embrionario, extraiga un mililitro de los embriones en la aguja e inmediatamente expulse de nuevo al tubo.
Pase los embriones fragmentados a través de un tamiz de filtro de células de 100 micrómetros colocado en un embudo. Recoja los corazones filtrados en otro tubo de centrífuga de cinco mililitros. Mezcle bien el filtrado y separe las alícuotas de un mililitro en tubos de centrífuga de 1,5 mililitros.
Centrifugar todos los tubos en una minicentrífuga de sobremesa durante cinco segundos y desechar el sobrenadante. Realizar la resuspensión en serie de los pellets en los tubos utilizando un mililitro de tampón de perfusión. Pipetear suavemente los corazones hacia arriba y hacia abajo dos veces antes de agregar una gota para los estudios correspondientes Para las células aisladas del bulbo arterial, las células del músculo liso vascular se confirmaron mediante la expresión tagln:EGFP.
Aquí se muestran trazas representativas de registros de actividad de canales de potasio sensibles al ATP de cardiomiocitos aislados. Se obtuvieron grabaciones exitosas de un solo canal en parches extirpados de los corazones embrionarios. Los miocitos ventriculares exhibieron potenciales de membrana hiperpolarizados estables, y los potenciales de acción fueron estimulados a través de la inyección de corriente a través de la pipeta del parche.
Los miocitos auriculares mostraron un potencial de acción espontánea. Las propiedades potenciales de acción se resumen aquí. Al reemplazar los tampones durante la disociación de cardiomiocitos, se debe tener cuidado de que los tejidos digestivos no se alteren.
La fragmentación del tejido debe lograrse solo mediante trituración con pipetas. Durante la digestión colágena de los tejidos del bulbo, examine los tejidos flotantes, dilatados y translúcidos cada minuto. Una vez que la fragmentación del tejido es evidente, cesa la digestión.
Una vez que las células están aisladas, pueden mantenerse vivas durante horas y usarse para análisis electrofisiológicos utilizando técnicas de pinza de parche. Esto nos ha permitido, por ejemplo, demostrar que los canales de potasio sensibles al ATP en estos tejidos de pez cebra son esencialmente idénticos a los de los mamíferos.
