Estudar propriedades do canal de íons nativos usando eletrofisiologia de grampos requer acesso a células isoladas agudamente. Este protocolo descreve métodos para acessar miócitos cardiovasculares individuais de zebrafish em diferentes idades. Este protocolo é robusto, simples, facilmente reproduzível, e isola miócitos cardiovasculares de zebrafish em seu estado natal com rendimento e viabilidade relativamente altos.
Para começar, transfira o peixe para uma grande placa de Petri parcialmente preenchida com tampão de perfusão e coloque-o sob um microscópio dissecando. Segure o peixe na mão não dominante com o lado ventral voltado para o escopo de dissecção. Com os fórceps finos na mão dominante, rasgue suavemente os músculos peitorais e as barbatanas do peixe para revelar os tecidos cardiovasculares, incluindo átrio, ventrículo e bulbo arteriosus.
Puxe suavemente o bulbus arteriosus na ponta interseccionar do bulbo arteriosus e da aorta ventral. Separe cuidadosamente o bulbo arterioso da aorta beliscando os fórceps, localizando a ponta do átrio nos múltiplos ramos venosos que convergem. Em seguida, tire a ponta do átrio do ânseio do seio para isolar os tecidos cardiovasculares do resto do corpo.
Para dissecar cardiomiócitos, arrancar o átrio e ventrículo do tecido cardiovascular. Faça uma ruptura suave no ventrículo usando fórceps finos para drenar o excesso de sangue, o que pode ser assegurado quando o tecido cardíaco passa de vermelho brilhante para uma cor de salmão pálido. Acumule o átrio isolado e o ventrículo em um tubo de centrífuga separado de 1,5 mililitro contendo tampão de perfusão.
Substitua o tampão de perfusão nos tubos por 750 microliters de tampão de digestão. Coloque os tubos em um termoshaker a 37 graus Celsius e 800 rotações por minuto. Permita a digestão dos tecidos até que se tornem translúcidos.
Acabe com a digestão girando suavemente os tecidos em uma minicentrifuagem de bancada a 2.000 vezes G por três a cinco segundos e substitua o tampão de digestão sobrenante por 750 microliters de tampão de parada. Substitua suavemente o tampão de parada por 500 a 750 microliters de tampão de perfusão e triturar os tecidos 30 vezes usando uma pipeta Pasteur polida em chamas para dispersar as células. Em seguida, triturar suavemente os ventrículos.
Para amostragem uniforme, pipete suavemente as células para cima e para baixo algumas vezes para resuspend, antes de adicionar uma gota delas para estudos correspondentes. Retire o bulbo arteriosus adulto dos tecidos cardiovasculares e poça cinco bulbus arteriosus em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro contendo tampão S1. Substitua o S1 por 400 microliters de tampão S2 e permita a digestão papain do bulbo arteriosus em um termoshaker a 37 graus Celsius e 800 rotações por minuto durante 20 minutos.
Deixe que o bulbus arteriosus parcialmente digerido se acalme por um minuto e substitua o supernatante S2 por 500 microliters de tampão S3 contendo colagemnase. Digerir os tecidos em um termoshaker a 37 graus Celsius e 800 revoluções por minuto por três a cinco minutos. Acabe com a digestão girando suavemente os tecidos em uma minicentrifutura de bancada a 2.000 vezes G por três a cinco segundos, e substitua o supernatante S3 por 500 microliters de S1. Triturar suavemente os tecidos pelleted para dispersar células musculares lisas vasculares.
Placa dispersou células musculares lisas vasculares em deslizamentos de tampa de vidro de tamanho apropriado. Mantenha os deslizamentos de cobertura em temperatura ambiente por 30 minutos para as células anexarem e use-as nas próximas seis horas. Anestesiar os embriões.
Em seguida, concentre os embriões transferindo-os para um tubo de centrífuga de cinco mililitros e, em seguida, remova o excesso de mídia. Lave os embriões com três mililitros de tampão de perfusão fria duas vezes, depois resuspensá-los em dois mililitros de tampão de perfusão. Usando o aparelho de isolamento cardíaco embrionário, desenhe um mililitro dos embriões na agulha e expulse-os imediatamente para o tubo.
Passe os embriões fragmentados através de uma peneira de 100 micrômetros colocada em um funil. Colete os corações filtrados em outro tubo de centrífuga de cinco mililitros. Misture bem o filtrado e separe as alíquotas de um mililitro em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro.
Centrifugar todos os tubos em uma minicentrifuagem de bancada por cinco segundos e descarte o supernatante. Realize a ressuspensão serial das pelotas nos tubos usando um mililitro de tampão de perfusão. Pipeta suavemente os corações para cima e para baixo duas vezes antes de adicionar uma gota para estudos correspondentes Para células isoladas de bulbus arteriosus, as células musculares lisas vasculares foram confirmadas pela expressão tagln:EGFP.
Traços representativos de gravações de atividade de canal de potássio sensível ao ATP de cardiomiócitos isolados são mostrados aqui. Gravações de um único canal bem sucedidas foram obtidas em patches extirpados dos corações embrionários. Os miócitos ventriculares apresentaram potenciais estáveis de membrana hiperpolarizada, e os potenciais de ação foram estimulados através da injeção atual através da pipeta de remendo.
Miócitos atrial exibiam ação espontânea potencial de disparo. As propriedades potenciais de ação são resumidas aqui. Ao substituir os tampões durante a dissociação da cardiomiócito, deve-se tomar cuidado para que os tecidos digestivos não sejam perturbados.
A fragmentação tecidual deve ser realizada apenas por trituração de pipeta. Durante a digestão colágena dos tecidos bulbosos, examine para tecidos flutuantes, dilatados e translúcidos a cada minuto. Uma vez que a fragmentação do tecido é aparente, cesse a digestão.
Uma vez que as células são isoladas, elas podem ser mantidas vivas por horas e usadas para análise eletrofisiológica usando técnicas de grampo de remendo. Isso nos permitiu, por exemplo, mostrar que os canais de potássio sensíveis ao ATP nesses tecidos de zebrafish são essencialmente idênticos aos dos mamíferos.
