Die Untersuchung nativer Ionenkanaleigenschaften mittels Patch-Clamp-Elektrophysiologie erfordert den Zugang zu akut isolierten Zellen. Dieses Protokoll beschreibt Methoden für den Zugang zu einzelnen kardiovaskulären Myozyten von Zebrafischen in verschiedenen Altersstufen. Dieses Protokoll ist robust, einfach, leicht reproduzierbar und isoliert kardiovaskuläre Myozyten aus Zebrafischen in ihrem nativen Zustand mit relativ hohem Ertrag und Lebensfähigkeit.
Um zu beginnen, geben Sie den Fisch in eine große Petrischale, die teilweise mit Perfusionspuffer gefüllt ist, und legen Sie ihn unter ein Seziermikroskop. Halten Sie den Fisch in der nicht dominanten Hand, wobei die ventrale Seite dem Sezierbereich zugewandt ist. Mit der feinen Pinzette in der dominanten Hand reißen Sie vorsichtig die Brustmuskeln und Flossen des Fisches auf, um das kardiovaskuläre Gewebe einschließlich Vorhof, Ventrikel und Bulbus arteriosus freizulegen.
Ziehen Sie den Bulbus arteriosus vorsichtig an der sich kreuzenden Spitze des Bulbus arteriosus und der ventralen Aorta. Trennen Sie den Bulbus arteriosus vorsichtig von der Aorta, indem Sie die Pinzette kneifen und die Spitze des Vorhofs in die mehreren Venenäste einordnen, die zusammenlaufen. Dann zupfen Sie die Spitze des Atriums vom Sinus venosus, um das kardiovaskuläre Gewebe vom Rest des Körpers zu isolieren.
Um Kardiomyozyten zu sezieren, zupfen Sie den Vorhof und den Ventrikel aus dem kardiovaskulären Gewebe. Machen Sie einen sanften Riss in den Ventrikel mit feinen Pinzetten, um überschüssiges Blut abzulassen, was sichergestellt werden kann, wenn das Herzgewebe von leuchtend rot zu einer blassen Lachsfarbe wird. Poolen Sie das isolierte Atrium und den Ventrikel in einem separaten 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit Perfusionspuffer.
Ersetzen Sie den Perfusionspuffer in den Röhrchen durch 750 Mikroliter Verdauungspuffer. Legen Sie die Schläuche auf einen Thermoshaker bei 37 Grad Celsius und 800 Umdrehungen pro Minute. Lassen Sie die Verdauung der Gewebe zu, bis sie durchscheinend werden.
Beenden Sie die Verdauung, indem Sie das Gewebe in einer Tisch-Minizentrifuge bei 2.000 Mal G für drei bis fünf Sekunden vorsichtig herunterdrehen und den überstehenden Verdauungspuffer durch 750 Mikroliter Stopppuffer ersetzen. Ersetzen Sie den Stopppuffer vorsichtig durch 500 bis 750 Mikroliter Perfusionspuffer und trituieren Sie das Gewebe 30 Mal mit einer flammpolierten Pasteur-Pipette, um die Zellen zu dispergieren. Dann trituieren Sie sanft die Ventrikel.
Für eine gleichmäßige Probenahme pipetten Sie die Zellen vorsichtig ein paar Mal nach oben und unten, um sie zu resuspendieren, bevor Sie einen Tropfen von ihnen für entsprechende Studien hinzufügen. Zupfen Sie den erwachsenen Bulbus arteriosus aus dem Herz-Kreislauf-Gewebe und fassen Sie fünf Bulbus arteriosus in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit S1-Puffer. Ersetzen Sie S1 durch 400 Mikroliter S2-Puffer und lassen Sie die Papain-Verdauung des Bulbus arteriosus auf einem Thermoshaker bei 37 Grad Celsius und 800 Umdrehungen pro Minute für 20 Minuten zu.
Lassen Sie den teilweise verdauten Bulbus arteriosus für eine Minute ruhen und ersetzen Sie den S2-Überstand durch 500 Mikroliter S3-Puffer mit Kollagenase. Verdauen Sie das Gewebe auf einem Thermoshaker bei 37 Grad Celsius und 800 Umdrehungen pro Minute für drei bis fünf Minuten. Beenden Sie die Verdauung, indem Sie das Gewebe in einer Tisch-Minizentrifuge bei 2.000 Mal G für drei bis fünf Sekunden vorsichtig herunterdrehen und den S3-Überstand durch 500 Mikroliter S1 ersetzen. Trituieren Sie das pelletierte Gewebe sanft, um die glatten Gefäßmuskelzellen zu verteilen.
Platte verteilte vaskuläre glatte Muskelzellen auf Glasabdeckungsgläser geeigneter Größe. Bewahren Sie die Deckgläser 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf, damit die Zellen sie anbringen können, und verwenden Sie sie innerhalb der nächsten sechs Stunden. Betäuben Sie die Embryonen.
Dann konzentrieren Sie die Embryonen, indem Sie sie in ein Fünf-Milliliter-Zentrifugenröhrchen übertragen und dann überschüssiges Medium entfernen. Waschen Sie die Embryonen zweimal mit drei Milliliter kaltem Perfusionspuffer und resuspendieren Sie sie dann in zwei Milliliter Perfusionspuffer. Mit dem embryonalen Herzisolierungsapparat einen Milliliter der Embryonen in die Nadel ziehen und sofort wieder in die Röhre ausstoßen.
Führen Sie die fragmentierten Embryonen durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb, das in einem Trichter platziert ist. Sammeln Sie die gefilterten Herzen in einem weiteren Fünf-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Mischen Sie das Filtrat gut und trennen Sie Ein-Milliliter-Aliquots in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Zentrifugieren Sie alle Röhrchen fünf Sekunden lang auf einer Tisch-Minizentrifuge und entsorgen Sie den Überstand. Führen Sie eine serielle Resuspension der Pellets in den Röhrchen mit einem Milliliter Perfusionspuffer durch. Pipettieren Sie die Herzen vorsichtig zweimal auf und ab, bevor Sie einen Tropfen für entsprechende Studien hinzufügen Für Zellen, die aus Bulbus arteriosus isoliert wurden, wurden die vaskulären glatten Muskelzellen durch tagln:EGFP-Expression bestätigt.
Repräsentative Spuren von Aufzeichnungen der ATP-sensitiven Kaliumkanalaktivität aus isolierten Kardiomyozyten sind hier dargestellt. Erfolgreiche Einkanalaufnahmen wurden in Pflastern erhalten, die aus den embryonalen Herzen herausgeschnitten wurden. Ventrikuläre Myozyten zeigten stabile hyperpolarisierte Membranpotentiale, und Aktionspotentiale wurden durch Strominjektion durch die Pflasterpipette stimuliert.
Vorhofmyozyten zeigten ein spontanes Aktionspotential. Aktionspotenzialeigenschaften sind hier zusammengefasst. Beim Austausch der Puffer während der Kardiomyozytendissoziation sollte darauf geachtet werden, dass das Verdauungsgewebe nicht gestört wird.
Die Gewebefragmentierung sollte nur durch Pipettenverreibung erreicht werden. Während der kollagenen Verdauung des Bulbusgewebes jede Minute auf schwimmendes, erweitertes und durchscheinendes Gewebe untersuchen. Sobald die Gewebefragmentierung offensichtlich ist, beenden Sie die Verdauung.
Sobald die Zellen isoliert sind, können sie stundenlang am Leben erhalten und für elektrophysiologische Analysen mit Patch-Clamp-Techniken verwendet werden. So konnten wir beispielsweise zeigen, dass ATP-empfindliche Kaliumkanäle in diesen Zebrafischgeweben im Wesentlichen identisch mit denen von Säugetieren sind.
