L’étude des propriétés des canaux ioniques natifs à l’aide de l’électrophysiologie des pinces patch nécessite l’accès à des cellules isolées de manière aiguë. Ce protocole décrit des méthodes pour accéder aux myocytes cardiovasculaires individuels du poisson zèbre à différents âges. Ce protocole est robuste, simple, facilement reproductible et isole les myocytes cardiovasculaires du poisson zèbre dans leur état natif avec un rendement et une viabilité relativement élevés.
Pour commencer, transférez le poisson dans une grande boîte de Petri partiellement remplie de tampon de perfusion et placez-la sous un microscope à dissection. Tenez le poisson dans la main non dominante avec la face ventrale faisant face à la lunette de dissection. Avec la pince fine dans la main dominante, déchirez doucement les muscles pectoraux et les nageoires du poisson pour révéler les tissus cardiovasculaires, y compris l’oreillette, le ventricule et le bulbe artériel.
Tirez doucement le bulbus artériel à l’extrémité intersectaire du bulbe artériel et de l’aorte ventrale. Séparez soigneusement le bulbe artériel de l’aorte en pinçant la pince, en localisant l’extrémité de l’oreillette dans les multiples branches veineuses qui convergent. Ensuite, arrachez l’extrémité de l’oreillette du sinus veineux pour isoler les tissus cardiovasculaires du reste du corps.
Pour disséquer les cardiomyocytes, arrachez l’oreillette et le ventricule du tissu cardiovasculaire. Faites une déchirure douce dans le ventricule à l’aide d’une pince fine pour drainer l’excès de sang, ce qui peut être assuré lorsque le tissu cardiaque passe du rouge vif à une couleur saumon pâle. Regrouper l’oreillette et le ventricule isolés dans un tube centrifuge séparé de 1,5 millilitre contenant un tampon de perfusion.
Remplacez le tampon de perfusion dans les tubes par 750 microlitres de tampon de digestion. Placez les tubes sur un thermoshaker à 37 degrés Celsius et 800 tours par minute. Permettre la digestion des tissus jusqu’à ce qu’ils deviennent translucides.
Terminez la digestion en faisant tourner doucement les tissus dans une minicentrifugeuse de paillasse à 2 000 fois G pendant trois à cinq secondes et remplacez le tampon de digestion surnageant par 750 microlitres de tampon d’arrêt. Remplacez délicatement le tampon d’arrêt par 500 à 750 microlitres de tampon de perfusion et triturez les tissus 30 fois à l’aide d’une pipette Pasteur polie à la flamme pour disperser les cellules. Ensuite, triturez doucement les ventricules.
Pour un échantillonnage uniforme, pipeter doucement les cellules de haut en bas plusieurs fois pour les remettre en suspension, avant d’en ajouter une goutte pour les études correspondantes. Arracher le bulbus artériel adulte des tissus cardiovasculaires et regrouper cinq bulbus artériels dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre contenant un tampon S1. Remplacer S1 par 400 microlitres de tampon S2 et permettre la digestion papaïne du bulbus artériel sur un thermoshaker à 37 degrés Celsius et 800 tours par minute pendant 20 minutes.
Laissez le bulbus artériel partiellement digéré se déposer pendant une minute et remplacez le surnageant S2 par 500 microlitres de tampon S3 contenant du collagénase. Digérer les tissus sur un thermoshaker à 37 degrés Celsius et 800 tours par minute pendant trois à cinq minutes. Terminez la digestion en faisant tourner doucement les tissus dans une minicentrifugeuse de paillasse à 2 000 fois G pendant trois à cinq secondes, et remplacez le surnageant S3 par 500 microlitres de S1. Triturer doucement les tissus granulés pour disperser les cellules musculaires lisses vasculaires.
Plaque dispersée les cellules musculaires lisses vasculaires sur des lamelles de verre de taille appropriée. Conservez les bordereaux de couvercle à température ambiante pendant 30 minutes pour que les cellules puissent s’y fixer et utilisez-les dans les six heures suivantes. Anesthésier les embryons.
Ensuite, concentrez les embryons en les transférant dans un tube centrifuge de cinq millilitres, puis retirez l’excès de milieu. Lavez les embryons avec trois millilitres de tampon de perfusion à froid deux fois, puis remettez-les en suspension dans deux millilitres de tampon de perfusion. À l’aide de l’appareil d’isolation cardiaque embryonnaire, aspirez un millilitre d’embryons dans l’aiguille et expulsez-les immédiatement dans le tube.
Passez les embryons fragmentés à travers un tamis à tamis à tamis cellulaire de 100 micromètres placé dans un entonnoir. Rassemblez les cœurs filtrés dans un autre tube centrifuge de cinq millilitres. Bien mélanger le filtrat et séparer les aliquotes d’un millilitre dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre.
Centrifuger tous les tubes d’une minicentrifugeuse de paillasse pendant cinq secondes et jeter le surnageant. Effectuer une remise en suspension en série des pastilles dans les tubes en utilisant un millilitre de tampon de perfusion. Pipeter doucement les cœurs de haut en bas deux fois avant d’ajouter une goutte pour les études correspondantes Pour les cellules isolées du bulbus artériel, les cellules musculaires lisses vasculaires ont été confirmées par tagln:expression EGFP.
Des traces représentatives d’enregistrements de l’activité des canaux potassiques sensibles à l’ATP à partir de cardiomyocytes isolés sont présentées ici. Des enregistrements monocanaux réussis ont été obtenus dans des patchs excisés des cœurs embryonnaires. Les myocytes ventriculaires présentaient des potentiels membranaires hyperpolarisés stables, et les potentiels d’action étaient stimulés par injection de courant à travers la pipette patch.
Les myocytes auriculaires présentaient un potentiel d’action spontanée. Les propriétés du potentiel d’action sont résumées ici. Lors du remplacement des tampons lors de la dissociation des cardiomyocytes , il faut veiller à ce que les tissus digestifs ne soient pas perturbés.
La fragmentation tissulaire ne doit être réalisée que par trituration à la pipette. Pendant la digestion collagène des tissus bulbeux, examinez les tissus flottants, dilatés et translucides toutes les minutes. Une fois que la fragmentation tissulaire est apparente, arrêtez la digestion.
Une fois les cellules isolées, elles peuvent être maintenues en vie pendant des heures et utilisées pour l’analyse électrophysiologique à l’aide de techniques de pince patch. Cela nous a permis, par exemple, de montrer que les canaux potassiques sensibles à l’ATP dans ces tissus de poisson zèbre sont essentiellement identiques à ceux des mammifères.
