Изучение свойств нативных ионных каналов с помощью электрофизиологии патч-зажима требует доступа к остро изолированным клеткам. Этот протокол описывает методы доступа к отдельным сердечно-сосудистым миоцитам от рыбок данио в разном возрасте. Этот протокол является надежным, простым, легко воспроизводимым и изолирует сердечно-сосудистые миоциты от рыбок данио в их родном состоянии с относительно высокой урожайностью и жизнеспособностью.
Для начала переложите рыбу в большую чашку Петри, частично заполненную перфузионным буфером, и поместите ее под рассекающий микроскоп. Держите рыбу в недоминирующей руке брюшной стороной лицом к рассечению. С тонкими щипцами в доминирующей руке осторожно разорвите грудные мышцы и плавники рыбы, чтобы выявить сердечно-сосудистые ткани, включая предсердие, желудочек и bulbus arteriosus.
Осторожно потяните bulbus arteriosus на пересекающемся кончике bulbus arteriosus и вентральной аорты. Осторожно отделите bulbus arteriosus от аорты, защемляя щипцы, располагая кончик предсердий в нескольких венозных ветвях, которые сходятся. Затем отсоедините кончик предсердия от синусового венозуса, чтобы изолировать сердечно-сосудистые ткани от остальной части тела.
Чтобы рассечь кардиомиоциты, вырвите предсердие и желудочек из сердечно-сосудистой ткани. Сделайте нежный разрыв в желудочек, используя тонкие щипцы, чтобы слить лишнюю кровь, что может быть обеспечено, когда сердечная ткань превратится из ярко-красного в бледно-лососевый цвет. Объедините изолированное предсердие и желудочек в отдельную 1,5-миллилитровую центрифужную трубку, содержащую перфузионный буфер.
Замените перфузионный буфер в пробирках 750 микролитрами буфера пищеварения. Поместите трубки на термошарик при 37 градусах Цельсия и 800 оборотах в минуту. Допускайте переваривание тканей до тех пор, пока они не станут полупрозрачными.
Завершите пищеварение, осторожно раскручивая ткани в мини-центрифуге в 2000 раз G в течение трех-пяти секунд и замените буфер пищеварения супернатанта 750 микролитрами остановочного буфера. Осторожно замените останавливающий буфер от 500 до 750 микролитров перфузионного буфера и тритурируйте ткани 30 раз, используя огнеполированную пипетку Пастера для диспергирования клеток. Затем аккуратно протритурируйте желудочки.
Для равномерного отбора проб осторожно перемешайте клетки вверх и вниз пару раз, чтобы повторно суспендировать, прежде чем добавить каплю их для соответствующих исследований. Выщипните взрослый bulbus arteriosus из сердечно-сосудистых тканей и объедините пять bulbus arteriosus в 1,5-миллилитрную центрифужную трубку, содержащую буфер S1. Замените S1 400 микролитрами буфера S2 и позвольте папаину переваривать bulbus arteriosus на термошейкере при 37 градусах Цельсия и 800 оборотах в минуту в течение 20 минут.
Дайте частично переваренному bulbus arteriosus успокоиться на одну минуту и замените супернатант S2 500 микролитрами буфера S3, содержащего коллагеназу. Переваривайте ткани на термошейкере при 37 градусах Цельсия и 800 оборотах в минуту в течение трех-пяти минут. Завершите пищеварение, осторожно раскручивая ткани в мини-центрифуге на 2000 раз G в течение трех-пяти секунд, и замените супернатант S3 на 500 микролитров S1. Аккуратно тритурируйте гранулированные ткани, чтобы рассеять гладкомышечные клетки сосудов.
Пластинчатые диспергированные сосудистые гладкомышечные клетки на стеклянных крышках слипов соответствующего размера. Держите крышку при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы клетки прикрепились, и используйте их в течение следующих шести часов. Обезболивают эмбрионы.
Затем сконцентрируйте эмбрионы, перенеся их в пятимиллилитровую центрифужную трубку, затем удалите лишнюю среду. Дважды промыть эмбрионы тремя миллилитрами буфера холодной перфузии, затем повторно суспендировать их в двух миллилитрах перфузионного буфера. Используя аппарат изоляции эмбрионального сердца, втяните один миллилитр эмбрионов в иглу и немедленно изгоните их обратно в трубку.
Пропустите фрагментированные эмбрионы через 100-микрометровое сито клеточного ситечка, помещенное в воронку. Соберите отфильтрованные сердца в другую пятимиллилитровую центрифужную трубку. Хорошо перемешайте фильтрат и разделите одномилитровые аликвоты в 1,5-миллилитровые центрифужные трубки.
Центрифугируйте все трубки на настольной мини-центрифуге в течение пяти секунд и выбросьте супернатант. Проводят серийную ресуспензию гранул в пробирках с использованием одного миллилитра перфузионного буфера. Осторожно пипеткой сердца вверх и вниз дважды, прежде чем добавить каплю для соответствующих исследований Для клеток, выделенных из bulbus arteriosus, сосудистые гладкомышечные клетки были подтверждены экспрессией tagln: EGFP.
Здесь показаны репрезентативные следы записей активности АТФ-чувствительных калиевых каналов от изолированных кардиомиоцитов. Успешные одноканальные записи были получены в пластырях, вырезанных из эмбриональных сердец. Желудочковые миоциты демонстрировали стабильные гиперполяризованные мембранные потенциалы, а потенциалы действия стимулировались с помощью инъекции тока через пипетку пластыря.
Предсердные миоциты проявляли спонтанное возбуждение потенциала действия. Свойства потенциала действия обобщены здесь. При замене буферов во время диссоциации кардиомиоцитов следует позаботиться о том, чтобы пищеварительные ткани не были нарушены.
Фрагментация тканей должна осуществляться только тритурацией пипетки. Во время коллагенового переваривания тканей бульбуса каждую минуту исследуйте на наличие плавающих, расширенных и полупрозрачных тканей. Как только фрагментация тканей очевидна, прекратите пищеварение.
Как только клетки изолированы, их можно поддерживать в живых в течение нескольких часов и использовать для электрофизиологического анализа с использованием методов зажима пластыря. Это позволило нам, например, показать, что АТФ-чувствительные калиевые каналы в этих тканях рыбок данио по существу идентичны таковым у млекопитающих.
