يبسط هذا البروتوكول تحديد الببتيدات البكتيرية glycop٪ ، مما يمكن الباحثين من تحديد أحداث glycosylation الجديدة ، وكذلك الاختلافات في الجليكان المستخدمة في glycosylation بين السلالات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تمكن خبراء غير الغليكوزيل من تحديد أحداث الجليكوزيل المحتملة في عينات البروتيوم البكتيرية. البحث المفتوح هو نهج قابل للتطبيق بشكل عام يمكن استخدامه لتحديد مجموعة من التعديلات ، وليس فقط الغليكوزيل ، ويمكن تطبيقه على أي عينة بروتينية.
لإعداد نصائح استخراج STB-RPS للتوقف والانطلاق، استخدم إبرة حادة قياس 14 لاستئصال ثلاثة أقراص STB-RPS من غشاء STB-RPS بمساحة 47 ملليمترا مربعا لربط 50 ميكروغرام من الببتيد. بالنسبة لكميات الببتيد الأكبر ، قم بزيادة عدد الأقراص وفقا لذلك. قبل استخدام نصائح المرحلة SDB-RPS ، اغسل النصائح بإضافة 150 ميكرولتر من الأسيتونيتريل بنسبة 100٪ وتدوير المخزن المؤقت عن طريق الطرد المركزي أو الضغط بلطف باستخدام حقنة.
بعد ذلك ، اغسل النصائح ب 150 ميكرولتر من 30٪ ميثانول يحتوي على 1٪ TFA ، ثم قم بموازنة النصائح مع 150 ميكرولتر من 90٪ isopropanol تحتوي على 1٪ TFA. بعد التوازن، قم بتحميل عينات البروتيوم على أطراف مرحلة STB-RPS عن طريق الطرد المركزي أو باستخدام حقنة. ثم ، اغسل النصائح ب 150 ميكرولتر من 90٪ isopropanol تحتوي على 1٪ TFA تليها 150 ميكرولتر من 1٪ TFA.
لتمييع الببتيدات من نصائح مرحلة STB-RPS ، استخدم 150 ميكرولتر من هيدروكسيد الأمونيوم بنسبة 5٪ و 80٪ من الأسيتونيتريل المضاف إلى طرف واحد وجمع العينات المطفأة في أنابيب فردية عن طريق الضغط بلطف باستخدام حقنة. بدلا من ذلك ، إذا كان التخلص عن طريق الطرد المركزي ، استخدم 150 ميكرولتر في 5٪ هيدروكسيد الأمونيوم في 80٪ من الأسيتونيتريل المضاف إلى جميع أطراف المرحلة وجمعها في لوحة نظيفة. جفف الببتيدات المطفأة عن طريق الطرد المركزي بالتفريغ عند 25 درجة مئوية.
بعد ذلك ، لإثراء عينات glycopeptide ، قم بإعداد كروماتوغرافيا سائلة للتفاعل المحب للماء zwitterionic ، أو ZIC-HHILIC ، نصائح المرحلة. قم باستئصال قرص C8 واحد من غشاء C8 مساحته 470 ملليمترا مربعا باستخدام إبرة حادة ذات مقياس 14 وقم بتعبئة القرص في طرف P-200 لإنشاء فريت. ثم أضف ما يقرب من خمسة ملليمترات من مادة ZIC-HILIC المعاد تعليقها في 50٪ من الأسيتونيتريل على الفريت عن طريق الضغط بلطف باستخدام حقنة.
قبل استخدام الأطراف ، قم بموازنة الراتنج مع 20 وحدة تخزين مؤقت من ZIC-HILIC ، مع ترك 10 ميكرولترات من الحجم فوق الراتنج لضمان عدم جفاف الراتنج. بعد ذلك ، اغسل الراتنج بالتتابع ب 20 وحدة تخزين مؤقت لإعداد ZIC-HILIC متبوعا ب 20 وحدة تخزين من تخزين ZIC-HILIC أو المخزن المؤقت للغسيل. بعد ذلك ، أعد تعليق الببتيدات المهضومة والمجففة في مخزن التحميل المؤقت ZIC-HILIC إلى تركيز نهائي قدره أربعة ميكروغرام لكل ميكرولتر.
دوامة لفترة وجيزة لمدة دقيقة واحدة لضمان إعادة تعليق العينات ثم تدويرها لمدة دقيقة واحدة في 2000 مرة G و 25 درجة مئوية. بعد الدوران ، قم بتحميل عينة الببتيد المعاد تعليقها على عمود ZIC-HILIC المشروط ، ثم اغسل العمود ثلاث مرات ب 20 وحدة تخزين من مخزن تحميل ZIC-HILIC عن طريق الضغط بلطف باستخدام حقنة. وأخيرا، قم بالتخلص من الببتيدات السكرية مع 20 سريرا من المخزن المؤقت ZIC-HILIC في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر عن طريق الضغط بلطف باستخدام حقنة، ثم قم بتجفيف المحلول عن طريق الطرد المركزي بالتفريغ عند 25 درجة مئوية.
لتحليل LC-MS ، أعد تعليق العينات في Buffer A * إلى تركيز نهائي قدره ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر ، ثم قم بتحميل العينات على HPLC-UPLC مقترنا ب MS لتمكين فصل وتحديد الببتيدات السكرية. راقب جمع بيانات MS الناتجة ، مما يضمن جمع البيانات باستخدام المعلمات المطلوبة. لتحليل العينات الغنية بالبروتينات والجليكوببتيد، افتح FragPipe وانقر فوق علامة التبويب سير العمل.
من القائمة المنسدلة سير العمل، حدد الخيار فتح بحث وانقر فوق إضافة ملفات لاستيراد ملفات البيانات المراد البحث عنها في FragPipe. ثم انقر فوق علامة التبويب قاعدة البيانات متبوعة بتنزيل لتشغيل مدير التنزيل لتنزيل قواعد بيانات proteome من UniProt باستخدام رقم انضمام UniProt. ضمن مدير التنزيل، انقر فوق الخيار إضافة خداع وملوثات لدمج البروتينات المخادعة والملوثة في قاعدة البيانات هذه.
بعد ذلك، انقر فوق علامة التبويب MSFragger، ثم ضمن المربع ذروة المطابقة، قم بزيادة التسامح مع كتلة السلائف من 500 دالتون الافتراضي إلى 2000 دالتون لتحديد التعديلات الكبيرة. انقر فوق علامة التبويب تشغيل لتحديد موقع مخرجات FragPipe، ثم انقر فوق الزر تشغيل لبدء البحث. مع تعيين جليكوببتيدات عالية الثقة ، حدد الأيونات المرتبطة بالغليكان التي تتم ملاحظتها بشكل شائع لتحسين تحديد الجليكوببتيدات.
بعد ذلك ، انقر فوق علامة التبويب MSFragger وأضف كتل دلتا المحددة من الجليكان المرصود إلى أقسام التعديلات المتغيرة وإزاحة الكتلة مع كتل فردية مفصولة بشرطة مائلة. ثم أضف كتل الشظايا المرتبطة بالجليكان من هذه الجليكان إلى قسم Glyco / Labile Mods في MSFragger. وأخيرا، قم بتحميل جميع بيانات التصلب المتعدد المرتبطة بالدراسات البروتينية إلى مستودعات بروتينية مركزية، مثل مستودعات PRIDE أو MassIVE.
كشف البحث المفتوح عن سلالة Acinetobacter baumannii AB307-0294 عن كتلتين دلتا مهيمنتين تقابلان 648.25 و 692.28 دالتون. من المعروف أن كبسولة ACICU تتكون من وحدة رباعي السكاريد K المقابلة لكتلة متوقعة تبلغ 843.31 دالتون. يتوافق هيكل الكبسولة هذا مع كتلة دلتا الأكثر شيوعا داخل ACICU.
كشف تحليل البحث المفتوح للسلالة D1279779 عن وجود كتل دلتا متعددة تتفق مع 203.08 و 794.31 و 1588.62 دالتون. باستخدام الشرح الطيفي التفاعلي للببتيد ، تم تقييم الجليكوببتيدات التي تم تحديدها عبر ثلاث سلالات A.baumannii تكشف عن أيونات محتملة مرتبطة بالجليكان. أدت عمليات البحث التي تركز على الجلايكان إلى زيادة ملحوظة في العدد الإجمالي للتطابقات الطيفية بين الجليكوببتيد والببتيد المحددة عبر جميع سلالات A.baumannii الثلاث ، وهو ما يعادل زيادة بنسبة 37٪ في ACICU ، وزيادة بنسبة 117٪ في AB307-0294 ، وزيادة بنسبة 363٪ في D1279779.
بالنسبة لأحداث التصلب المتعدد الفردية، فإن إدراج معلومات خاصة بالغليكان عادة ما يزيد من درجة فرط النتيجة المرصودة، على الرغم من أن هذه الزيادة تعتمد بشكل كبير على الجليكان. عند القيام بتخصيب ZIC-HILIC ، تأكد من أن الراتنج يظل رطبا دائما ، لأن فقدان المذيبات قد يعرض للخطر عزل الجليكوببتيدات. يمكن استخدام البيانات المتعلقة بالاختلافات في الجليكوزيل لإثراء دراسات الطفرات أو تحديد فئات الجينات المسؤولة عن التخليق الحيوي للجلايكان.
باستخدام البحث في قاعدة البيانات المفتوحة ، بدأنا في توصيف تنوع الجليكان عبر الأجناس البكتيرية. وقد أظهر هذا أن الجليكوزيل البكتيري أكثر شيوعا وأكثر تنوعا مما كنا نعتقد في السابق.
