Questo protocollo semplifica l'identificazione degli eptidi batterici, consentendo ai ricercatori di identificare nuovi eventi di glicosilazione, nonché le differenze nei glicani utilizzati per la glicosilazione tra i ceppi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente agli esperti non di glicosilazione di identificare potenziali eventi di glicosilazione in campioni di proteoma batterico. La ricerca aperta è un approccio generalmente applicabile che può essere utilizzato per l'identificazione di una serie di modifiche, non solo la glicosilazione, e può essere applicato a qualsiasi campione di proteoma.
Per preparare le punte di estrazione stop-and-go STB-RPS, utilizzare un ago smussato calibro 14 per asportare tre dischi STB-RPS da una membrana STB-RPS da 47 millimetri quadrati per legare 50 microgrammi di peptide. Per quantità maggiori di peptidi, aumentare il numero di dischi di conseguenza. Prima di utilizzare le punte dello stadio SDB-RPS, lavare le punte aggiungendo 150 microlitri di acetonitrile al 100% e ruotando il tampone mediante centrifugazione o applicando delicatamente la pressione utilizzando una siringa.
Quindi, lavare le punte con 150 microlitri di metanolo al 30% contenenti l'1% di TFA, quindi equilibrare le punte con 150 microlitri di isopropanolo al 90% contenenti l'1% di TFA. Dopo l'equilibrio, caricare i campioni di proteoma sulle punte dello stadio STB-RPS mediante centrifugazione o utilizzando una siringa. Quindi, lavare le punte con 150 microlitri di isopropanolo al 90% contenenti 1% TFA seguiti da 150 microlitri dell'1% TFA.
Per eluire i peptidi dalle punte dello stadio STB-RPS, utilizzare 150 microlitri di idrossido di ammonio al 5% e acetonitrile all'80% aggiunti a una singola punta e raccogliere i campioni eluiti in singoli tubi applicando delicatamente la pressione utilizzando una siringa. In alternativa, se eluting tramite centrifugazione, utilizzare 150 microlitri al 5% di idrossido di ammonio in acetonitrile all'80% aggiunti a tutte le punte dello stadio e raccogliere in una piastra pulita. Asciugare i peptidi eluiti mediante centrifugazione sotto vuoto a 25 gradi Celsius.
Successivamente, per arricchire i campioni di glicopeptide, preparare una cromatografia liquida di interazione idrofila zwitterionica, o ZIC-HILIC, punte di scena. Asportare un disco C8 da una membrana C8 di 470 millimetri quadrati usando un ago smussato calibro 14 e imballare il disco in una punta P-200 per creare una fritta. Quindi, aggiungere circa cinque millimetri di materiale ZIC-HILIC risospeso al 50% in acetonitrile sulla fritta applicando delicatamente la pressione utilizzando una siringa.
Prima di utilizzare le punte, equilibrare la resina con 20 volumi di letto di tampone di eluizione ZIC-HILIC, lasciando 10 microlitri di volume sopra la resina per garantire che la resina non si asciughi. Quindi, lavare sequenzialmente la resina con 20 volumi di letto di tampone di preparazione ZIC-HILIC seguiti da 20 volumi di letto di tampone di carico o di lavaggio ZIC-HILIC. Successivamente, risospesare i peptidi digeriti ed essiccati nel tampone di carico ZIC-HILIC a una concentrazione finale di quattro microgrammi per microlitro.
Vortice brevemente per un minuto per garantire che i campioni siano risospesi, quindi girali per un minuto a 2000 volte G e 25 gradi Celsius. Dopo la rotazione, caricare il campione di peptide risospeso sulla colonna ZIC-HILIC condizionata, quindi lavare la colonna tre volte con 20 volumi di letto del tampone di carico ZIC-HILIC applicando delicatamente la pressione utilizzando una siringa. Infine, eluire i glicopeptidi con 20 volumi di letto del tampone di eluizione ZIC-HILIC in un tubo da 1,5 millilitri applicando delicatamente la pressione usando una siringa, quindi asciugare l'eluente mediante centrifugazione sotto vuoto a 25 gradi Celsius.
Per l'analisi LC-MS, risospesare i campioni nel tampone A * a una concentrazione finale di un microgrammo per microlitro, quindi caricare i campioni su un HPLC-UPLC accoppiato a un MS per consentire la separazione e l'identificazione dei glicopeptidi. Monitorare la raccolta dei dati MS risultante, assicurandosi che i dati vengano raccolti con i parametri desiderati. Per analizzare i campioni arricchiti di proteoma e glicopeptide, aprire FragPipe e fare clic sulla scheda Flusso di lavoro.
Dal menu a discesa Flusso di lavoro, selezionare l'opzione Apri ricerca e fare clic su Aggiungi file per importare i file di dati da cercare in FragPipe. Quindi, fare clic sulla scheda Database seguita da Download per avviare il download manager per il download di database proteome da UniProt utilizzando un numero di adesione UniProt. All'interno del download manager, fare clic sull'opzione Aggiungi esche e contaminanti per incorporare proteine esca e contaminanti in questo database.
Quindi, fare clic sulla scheda MSFragger, quindi nella casella Corrispondenza picco aumentare la tolleranza di massa del precursore dalton predefinito 500 a 2.000 dalton per identificare le modifiche di grandi dimensioni. Fare clic sulla scheda Esegui per definire la posizione degli output di FragPipe, quindi fare clic sul pulsante Esegui per iniziare la ricerca. Con i glicopeptidi ad alta confidenza assegnati, identificare gli ioni comunemente osservati associati ai glicani per migliorare l'identificazione dei glicopeptidi.
Quindi, fare clic sulla scheda MSFragger e aggiungere le masse delta determinate dei glicani osservati nelle sezioni Modifiche variabili e Offset di massa con singole masse separate da una barra. Quindi, aggiungere le masse di frammenti associati al glicano di questi glicani nella sezione Glyco/Labile Mods di MSFragger. Infine, carica tutti i dati MS associati agli studi proteomici in repository proteomici centralizzati, come i repository PRIDE o MassIVE.
La ricerca aperta del ceppo Acinetobacter baumannii AB307-0294 ha rivelato due masse delta dominanti corrispondenti a 648,25 e 692,28 dalton. La capsula ACICU è nota per essere composta da un'unità tetrasaccaridica K corrispondente a una massa prevista di 843,31 dalton. Questa struttura della capsula è coerente con la massa delta più frequentemente osservata all'interno dell'ACICU.
L'analisi a ricerca aperta del ceppo D1279779 ha rivelato la presenza di masse delta multiple coerenti con i dalton 203.08, 794.31 e 1588.62. Utilizzando l'annotatore spettrale peptidico interattivo, i glicopeptidi identificati in tre ceppi di A.baumannii sono stati valutati rivelando potenziali ioni associati al glicano. Le ricerche focalizzate sul glicano hanno portato a un notevole aumento del numero totale di corrispondenze spettrali glicopeptidiche / peptidiche identificate in tutti e tre i ceppi di A.baumannii, corrispondente a un aumento del 37% di ACICU, un aumento del 117% in AB307-0294 e un aumento del 363% in D1279779.
Per i singoli eventi di SM, l'inclusione di informazioni specifiche del glicano in genere aumenta l'Hyperscore osservato, sebbene questo aumento sia altamente glicano-dipendente. Quando si esegue l'arricchimento ZIC-HILIC, assicurarsi che la resina rimanga sempre bagnata, poiché la perdita di solvente può compromettere l'isolamento dei glicopeptidi. I dati sulle differenze nella glicosilazione possono essere utilizzati per informare gli studi di mutagenesi o identificare le classi geniche responsabili della biosintesi dei glicani.
Utilizzando la ricerca in database aperto, abbiamo iniziato a caratterizzare la diversità dei glicani tra i generi batterici. Ciò ha dimostrato che la glicosilazione batterica è sia più comune che molto più diversificata di quanto pensassimo una volta.
