该协议简化了细菌糖苷%eptides的鉴定，使研究人员能够识别新的糖基化事件，以及菌株之间用于糖基化的聚糖的差异。该技术的主要优点是它使非糖基化专家能够识别细菌蛋白质组样品中潜在的糖基化事件。开放搜索是一种普遍适用的方法，可用于鉴定一系列修饰，而不仅仅是糖基化，并且可以应用于任何蛋白质组样品。
要制备 STB-RPS 即停即用提取吸头，请使用 14 号钝针从 47 平方毫米 STB-RPS 膜上切除三个 STB-RPS 盘，以结合 50 微克肽。对于较大的肽量，请相应地增加椎间盘的数量。在使用SDB-RPS载物台吸头之前，通过加入150微升100%乙腈并通过离心或使用注射器轻轻施加压力来旋转缓冲液来洗涤吸头。
接下来，用150微升含有1%TFA的30%甲醇洗涤尖端，然后用150微升含有1%TFA的90%异丙醇平衡尖端。平衡后，通过离心或使用注射器将蛋白质组样品加载到STB-RPS载物台尖端上。然后，用150微升含有1%TFA的90%异丙醇，然后用150微升1%TFA洗涤尖端。
为了从STB-RPS阶段尖端洗脱肽，使用150微升的5%氢氧化铵和80%乙腈加入单个尖端，并通过使用注射器轻轻施加压力将洗脱的样品收集在单个试管中。或者，如果通过离心洗脱，则使用150微升5%氢氧化铵，加入80%乙腈中，添加到所有阶段吸头中，并收集在干净的板中。通过在25摄氏度下真空离心干燥洗脱的肽。
接下来，为了富集糖肽样品，制备两性离子亲水相互作用液相色谱法，或ZIC-HILIC，阶段提示。使用 14 号钝针从 470 平方毫米 C8 膜上切下一个 C8 圆盘，然后将圆盘装入 P-200 尖端以形成熔块。然后，通过使用注射器轻轻施加压力，将约5毫米重悬于50%乙腈中的ZIC-HILIC材料加入熔块上。
在使用吸头之前，用20层体积的ZIC-HILIC洗脱缓冲液平衡树脂，在树脂上方留下10微升的体积，以确保树脂不会干燥。然后，用20层体积的ZIC-HILIC制备缓冲液依次洗涤树脂，然后用20层体积的ZIC-HILIC上样液或洗涤缓冲液洗涤树脂。接下来，将消化和干燥的肽重悬于ZIC-HILIC上样缓冲液中，最终浓度为每微升4微克。
短暂涡旋一分钟，以确保样品重悬，然后在2000倍G和25摄氏度下旋转一分钟。纺丝后，将重悬的肽样品上样到条件化的ZIC-HILIC色谱柱上，然后通过使用注射器轻轻施加压力，用20层体积的ZIC-HILIC上样缓冲液洗涤柱三次。最后，通过使用注射器轻轻施加压力，将具有20床体积的ZIC-HILIC洗脱缓冲液的糖肽洗脱到1.5毫升管中，然后通过25摄氏度的真空离心干燥淋洗液。
对于LC-MS分析，将缓冲液A*中的样品重悬至每微升1微克的最终浓度，然后将样品装载到与MS偶联的HPLC-UPLC上，以实现糖肽的分离和鉴定。监控生成的MS数据收集，确保使用所需参数收集数据。要分析蛋白质组和富含糖肽的样品，请打开 FragPipe，然后单击“工作流程”选项卡。
从工作流下拉菜单中，选择打开搜索选项，然后单击添加文件以将要搜索的数据文件导入 FragPipe。然后，单击“数据库”选项卡，然后单击“下载”以启动下载管理器，以使用 UniProt 加入号从 UniProt 下载蛋白质组数据库。在下载管理器中，单击添加诱饵和污染物选项，将诱饵和污染物蛋白质合并到此数据库中。
接下来，单击 MSFragger 选项卡，然后在“峰值匹配”框中，将“前体质量公差”从默认的 500 道尔顿增加到 2， 000 道尔顿，以识别较大的修改。单击“运行”选项卡以定义 FragPipe 输出的位置，然后单击“运行”按钮开始搜索。通过分配高置信度糖肽，鉴定通常观察到的聚糖相关离子以改善糖肽的鉴定。
接下来，单击 MSFragger 选项卡，并将观测到的聚糖的已确定的增量质量添加到变量修饰和质量偏移部分，并用斜杠分隔单个质量。然后，将这些聚糖的聚糖相关片段团添加到MSFragger的糖/Labile Mods部分。最后，将与蛋白质组学研究相关的所有MS数据上传到集中式蛋白质组学存储库，例如PRIDE或MassIVE存储库。
对鲍曼不动杆菌菌株AB307-0294的公开搜索显示，两个优势δ质量分别为648.25和692.28道尔顿。已知ACICU胶囊由四糖K单元组成，对应于预测质量为843.31道尔顿。这种胶囊结构与ACICU内最常观察到的δ质量一致。
菌株D1279779的开放搜索分析显示存在与203.08，794.31和1588.62道尔顿一致的多个δ质量。使用交互式肽光谱注释器，评估了在三种鲍曼氏菌菌株中鉴定出的糖肽，揭示了潜在的聚糖相关离子。以聚糖为重点的检索导致在所有三种鲍曼氏菌菌株中发现的糖肽/肽光谱匹配总数显着增加，对应于ACICU增加37%，AB307-0294增加117%，D1279779增加363%。
对于单个MS事件，包含聚糖特异性信息通常会增加观察到的Hyperscore，尽管这种增加是高度依赖聚糖的。在进行ZIC-HILIC富集时，请确保树脂始终保持湿润，因为溶剂的损失可能损害糖肽的分离。糖基化差异的数据可用于为诱变研究提供信息或确定负责聚糖生物合成的基因类别。
使用开放式数据库搜索，我们已经开始表征细菌属的聚糖多样性。这表明细菌糖基化比我们曾经想象的更常见，也更多样化。
