Este protocolo agiliza a identificação de glicop%eptides bacterianos, permitindo aos pesquisadores identificar novos eventos de glicosylação, bem como as diferenças nos glicanos utilizados para a glicosylação entre cepas. A principal vantagem dessa técnica é que permite que especialistas em não glicossylation identifiquem potenciais eventos de glicosylation em amostras de proteome bacteriano. A busca aberta é uma abordagem geralmente aplicável que pode ser usada para a identificação de uma série de modificações, não apenas glicosylation, e pode ser aplicada a qualquer amostra de proteome.
Para preparar as pontas de extração STB-RPS stop-and-go, use uma agulha sem medida de 14 bitola para extircular três discos STB-RPS de uma membrana STB-RPS de 47 milímetros para ligar 50 microgramas de peptídeo. Para maiores quantidades de peptídeos, aumente o número de discos em conformidade. Antes de usar as pontas do estágio SDB-RPS, lave as pontas adicionando 150 microliters de 100% acetonitrila e girando o buffer por centrifugação ou aplicando suavemente a pressão usando uma seringa.
Em seguida, lave as pontas com 150 microliters de 30% de metanol contendo 1%TFA, depois equilibre as pontas com 150 microliters de 90% de isopropanol contendo 1%TFA. Após o equilíbrio, carregue as amostras de proteome nas pontas do estágio STB-RPS por centrifugação ou usando uma seringa. Em seguida, lave as pontas com 150 microliters de 90% isopropanol contendo 1%TFA seguido por 150 microliters de 1%TFA.
Para elutar os peptídeos das pontas do estágio STB-RPS, use 150 microliters de hidróxido de amônio de 5% e 80% de acetonitrilo adicionado a uma única ponta e colete as amostras elucidadas em tubos individuais aplicando suavemente a pressão usando uma seringa. Alternativamente, se eludir via centrifugação, use 150 microlitres a hidróxido de amônio de 5% em 80% de acetonitrilo adicionado a todas as pontas do palco e colete em uma placa limpa. Seque os peptídeos elucidos por centrifugação a vácuo a 25 graus Celsius.
Em seguida, para enriquecer as amostras de glicocopeptopídio, prepare uma cromatografia líquida de interação hidrofílica zwitterionic, ou ZIC-HILIC, pontas de estágio. Extite um disco C8 de uma membrana C8 de 470 milímetros quadrados usando uma agulha contundente de calibre 14 e coloque o disco em uma ponta P-200 para criar um frit. Em seguida, adicione aproximadamente cinco milímetros de material ZIC-HILIC resuspendido em 50% de acetonitrilo sobre o frit, aplicando suavemente a pressão usando uma seringa.
Antes de usar as pontas, equilibre a resina com 20 volumes de cama de tampão de eluição ZIC-HILIC, deixando 10 microliters de volume acima da resina para garantir que a resina não seque. Em seguida, lave sequencialmente a resina com 20 volumes de cama de tampão de preparação ZIC-HILIC seguido por 20 volumes de cama de carregamento ZIC-HILIC ou tampão de lavagem. Em seguida, resuspenque os peptídeos digeridos e secos no tampão de carga ZIC-HILIC até uma concentração final de quatro microgramas por microliter.
Vórtice brevemente por um minuto para garantir que as amostras sejam resuspended, em seguida, gire-as por um minuto a 2000 vezes G e 25 graus Celsius. Depois de girar, carregue a amostra de peptídeo resuspended na coluna ZIC-HILIC condicionada e, em seguida, lave a coluna três vezes com 20 volumes de cama do tampão de carregamento ZIC-HILIC aplicando suavemente a pressão usando uma seringa. Finalmente, elute os glycopeptides com 20 volumes de cama do tampão de eluição ZIC-HILIC em um tubo de 1,5 mililitro, aplicando suavemente a pressão usando uma seringa, em seguida, seque o eluente por centrifugação a vácuo a 25 graus Celsius.
Para análise de LC-MS, resuspenja as amostras em Buffer A*para uma concentração final de um micrograma por microliter e, em seguida, carregue as amostras em um HPLC-UPLC acoplado a um MS para permitir a separação e identificação de glicacopeptídeos. Monitore a coleta de dados de MS resultante, garantindo que os dados sejam coletados com os parâmetros desejados. Para analisar as amostras enriquecidas com proteome e glicopticida, abra FragPipe e clique na guia Workflow.
No menu pull-down do Workflow, selecione a opção Abrir pesquisa e clique em Adicionar arquivos para importar os arquivos de dados a serem pesquisados no FragPipe. Em seguida, clique na guia Banco de dados seguida de Download para lançar o gerenciador de downloads para baixar bancos de dados proteome do UniProt usando um número de adesão UniProt. Dentro do gerenciador de downloads, clique na opção Adicionar isca e contaminantes para incorporar proteínas chamariz e contaminantes neste banco de dados.
Em seguida, clique na guia MSFragger, em seguida, dentro da caixa De correspondência de pico, aumente a tolerância de massa Precursor do padrão de 500 dalton para 2.000 dalton para identificar grandes modificações. Clique na guia Executar para definir a localização das saídas do FragPipe e clique no botão Executar para iniciar a pesquisa. Com glycopeptídeos de alta confiança atribuídos, identifique íons glicanos comumente observados para melhorar a identificação de glycopeptídeos.
Em seguida, clique na guia MSFragger e adicione as massas delta determinadas dos glicanos observados nas seções de modificações variáveis e deslocamentos de massa com massas individuais separadas com uma barra. Em seguida, adicione as massas de fragmentos associadas ao glicano desses glicanos na seção Glyco/Labile Mods do MSFragger. Finalmente, carregue todos os dados de MS associados a estudos proteômicos para repositórios proteômicos centralizados, como os repositórios PRIDE ou MassIVE.
A busca aberta da cepa Acinetobacter baumannii AB307-0294 revelou duas massas delta dominantes correspondentes a 648,25 e 692,28 daltons. A cápsula ACICU é conhecida por ser composta por uma unidade tetrassacarida K correspondente a uma massa prevista de 843,31 dalton. Esta estrutura da cápsula é consistente com a massa delta mais frequentemente observada dentro da ACICU.
A análise de busca aberta da cepa D1279779 revelou a presença de múltiplas massas delta consistentes com 203,08, 794,31 e 1588,62 daltons. Utilizando o anotador espectral de peptídeo interativo, os glicopeptídeos identificados em três cepas de A.baumannii foram avaliados revelando potenciais íons glicanos associados. As pesquisas focadas em glycan levaram a um aumento notável no número total de partidas espectrais de glicopto/peptídeo identificadas em todas as três cepas A.baumannii, correspondendo a um aumento de 37% no ACICU, um aumento de 117% no AB307-0294 e um aumento de 363% na D1279779.
Para eventos individuais de ES, a inclusão de informações específicas de glycan normalmente aumenta o Hyperscore observado, embora esse aumento seja altamente dependente de glycan. Ao realizar o enriquecimento ZIC-HILIC, certifique-se de que a resina permaneça sempre úmida, pois a perda de solvente pode comprometer o isolamento dos glipcopeptídeos. Dados sobre diferenças na glicossylation podem ser usados para informar estudos de mutagênese ou identificar classes genéticas responsáveis pela biossíntese glican.
Usando a pesquisa aberta do banco de dados, começamos a caracterizar a diversidade glican entre os gêneros bacterianos. Isso mostrou que a glicossylation bacteriana é ao mesmo tempo mais comum e muito mais diversificada do que pensávamos.
