Ce protocole rationalise l’identification des glycop%eptides bactériens, permettant aux chercheurs d’identifier de nouveaux événements de glycosylation, ainsi que les différences dans les glycanes utilisés pour la glycosylation entre les souches. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet aux experts non-glycosylation d’identifier les événements potentiels de glycosylation dans les échantillons de protéome bactérien. La recherche ouverte est une approche généralement applicable qui peut être utilisée pour identifier une gamme de modifications, pas seulement la glycosylation, et peut être appliquée à n’importe quel échantillon de protéome.
Pour préparer les embouts d’extraction STB-RPS stop-and-go, utilisez une aiguille émoussée de calibre 14 pour extraire trois disques STB-RPS d’une membrane STB-RPS de 47 millimètres carrés pour lier 50 microgrammes de peptide. Pour de plus grandes quantités de peptides, augmentez le nombre de disques en conséquence. Avant d’utiliser les embouts de scène SDB-RPS, lavez les embouts en ajoutant 150 microlitres d’acétonitrile à 100 % et en faisant tourner le tampon par centrifugation ou en appliquant doucement une pression à l’aide d’une seringue.
Ensuite, lavez les embouts avec 150 microlitres de 30% de méthanol contenant 1% de TFA, puis équilibrez les embouts avec 150 microlitres de 90% d’isopropanol contenant 1% de TFA. Après l’équilibrage, charger les échantillons de protéome sur les extrémités de l’étage STB-RPS par centrifugation ou à l’aide d’une seringue. Ensuite, lavez les embouts avec 150 microlitres d’isopropanol à 90% contenant 1% de TFA suivis de 150 microlitres de 1% de TFA.
Pour éluer les peptides des pointes d’étape STB-RPS, utilisez 150 microlitres d’hydroxyde d’ammonium à 5% et de 80% d’acétonitrile ajoutés à une seule pointe et collectez les échantillons élués dans des tubes individuels en appliquant doucement une pression à l’aide d’une seringue. Alternativement, si vous éluez par centrifugation, utilisez 150 microlitres à 5% d’hydroxyde d’ammonium dans 80% d’acétonitrile ajouté à toutes les extrémités de scène et collectez dans une plaque propre. Sécher les peptides élués par centrifugation sous vide à 25 degrés Celsius.
Ensuite, pour enrichir les échantillons de glycopeptides, préparez une chromatographie liquide à interaction hydrophile zwittérionique, ou ZIC-HILIC, embouts de stade. Retirez un disque C8 d’une membrane C8 de 470 millimètres carrés à l’aide d’une aiguille émoussée de calibre 14 et emballez le disque dans une pointe P-200 pour créer une fritte. Ensuite, ajoutez environ cinq millimètres de matériau ZIC-HILIC remis en suspension dans 50% d’acétonitrile sur la fritte en appliquant doucement une pression à l’aide d’une seringue.
Avant d’utiliser les embouts, équilibrez la résine avec 20 volumes de lit de tampon d’élution ZIC-HILIC, en laissant 10 microlitres de volume au-dessus de la résine pour vous assurer que la résine ne sèche pas. Ensuite, lavez séquentiellement la résine avec 20 volumes de lit de tampon de préparation ZIC-HILIC suivis de 20 volumes de lit de tampon de chargement ou de lavage ZIC-HILIC. Ensuite, remettez en suspension les peptides digérés et séchés dans le tampon de charge ZIC-HILIC jusqu’à une concentration finale de quatre microgrammes par microlitre.
Vortex brièvement pendant une minute pour s’assurer que les échantillons sont remis en suspension, puis les faire tourner pendant une minute à 2000 fois G et 25 degrés Celsius. Après la filature, chargez l’échantillon de peptide remis en suspension sur la colonne ZIC-HILIC conditionnée, puis lavez la colonne trois fois avec 20 volumes de lit du tampon de charge ZIC-HILIC en appliquant doucement une pression à l’aide d’une seringue. Enfin, éluez les glycopeptides avec 20 volumes de lit du tampon d’élution ZIC-HILIC dans un tube de 1,5 millilitre en appliquant doucement une pression à l’aide d’une seringue, puis séchez l’éluant par centrifugation sous vide à 25 degrés Celsius.
Pour l’analyse LC-MS, remettez en suspension les échantillons dans le tampon A * à une concentration finale d’un microgramme par microlitre, puis chargez les échantillons sur un HPLC-UPLC couplé à un MS pour permettre la séparation et l’identification des glycopeptides. Surveillez la collecte de données MS résultante, en vous assurant que les données sont collectées avec les paramètres souhaités. Pour analyser les échantillons enrichis en protéome et glycopeptide, ouvrez FragPipe et cliquez sur l’onglet Workflow.
Dans le menu déroulant Workflow, sélectionnez l’option Ouvrir la recherche et cliquez sur Ajouter des fichiers pour importer les fichiers de données à rechercher dans FragPipe. Cliquez ensuite sur l’onglet Base de données suivi de Télécharger pour lancer le gestionnaire de téléchargement pour télécharger les bases de données de protéome à partir d’UniProt à l’aide d’un numéro d’acquisition UniProt. Dans le gestionnaire de téléchargement, cliquez sur l’option Ajouter des leurres et des contaminants pour incorporer des protéines leurres et contaminants dans cette base de données.
Ensuite, cliquez sur l’onglet MSFragger, puis dans la zone Correspondance des pics, augmentez la tolérance de masse du précurseur de 500 dalton par défaut à 2 000 dalton pour identifier les modifications importantes. Cliquez sur l’onglet Exécuter pour définir l’emplacement des sorties de FragPipe, puis cliquez sur le bouton Exécuter pour lancer la recherche. Avec des glycopeptides à haute confiance attribués, identifiez les ions associés aux glycanes couramment observés pour améliorer l’identification des glycopeptides.
Ensuite, cliquez sur l’onglet MSFragger et ajoutez les masses delta déterminées des glycanes observés dans les sections Modifications variables et Décalages de masse avec des masses individuelles séparées par une barre oblique. Ensuite, ajoutez les masses de fragments associés aux glycanes de ces glycanes dans la section Glyco/Labile Mods de MSFragger. Enfin, téléchargez toutes les données sur la SP associées aux études protéomiques dans des dépôts protéomiques centralisés, tels que les dépôts PRIDE ou MassIVE.
La recherche ouverte de la souche AB307-0294 d’Acinetobacter baumannii a révélé deux masses delta dominantes correspondant à 648,25 et 692,28 daltons. La capsule ACICU est connue pour être composée d’une unité de tétrasaccharide K correspondant à une masse prévue de 843,31 dalton. Cette structure de capsule est cohérente avec la masse delta la plus fréquemment observée dans l’ACICU.
L’analyse de recherche ouverte de la souche D1279779 a révélé la présence de plusieurs masses delta compatibles avec 203,08, 794,31 et 1588,62 daltons. À l’aide de l’annotateur spectral de peptide interactif, les glycopeptides identifiés dans trois souches d’A.baumannii ont été évalués révélant des ions potentiels associés aux glycanes. Les recherches axées sur les glycanes ont entraîné une augmentation notable du nombre total de correspondances spectrales glycopeptide/peptide identifiées dans les trois souches d’A.baumannii, ce qui correspond à une augmentation de 37 % de l’ACICU, à une augmentation de 117 % de l’AB307-0294 et à une augmentation de 363 % de D1279779.
Pour les événements individuels de SEP, l’inclusion d’informations spécifiques au glycane augmente généralement l’hyperscore observé, bien que cette augmentation soit fortement dépendante du glycane. Lorsque vous entreprenez un enrichissement ZIC-HILIC, assurez-vous que la résine reste toujours humide, car la perte de solvant peut compromettre l’isolement des glycopeptides. Les données sur les différences de glycosylation peuvent être utilisées pour éclairer les études de mutagénèse ou identifier les classes de gènes responsables de la biosynthèse des glycanes.
En utilisant la recherche dans une base de données ouverte, nous avons commencé à caractériser la diversité des glycanes à travers les genres bactériens. Cela a montré que la glycosylation bactérienne est à la fois plus fréquente et beaucoup plus diversifiée que nous ne le pensions.
