Этот протокол упрощает идентификацию бактериальных гликоп%эптидов, позволяя исследователям идентифицировать новые события гликозилирования, а также различия в гликанах, используемых для гликозилирования между штаммами. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет экспертам по негликозилированию идентифицировать потенциальные события гликозилирования в образцах бактериального протеома. Открытый поиск является общеприменимым подходом, который может быть использован для идентификации ряда модификаций, а не только гликозилирования, и может быть применен к любому образцу протеома.
Чтобы подготовить наконечники для экстракции STB-RPS stop-and-go, используйте тупую иглу 14-го калибра, чтобы иссечь три диска STB-RPS из мембраны STB-RPS площадью 47 квадратных миллиметров для связывания 50 микрограммов пептида. Для больших количеств пептидов увеличьте количество дисков соответственно. Перед использованием наконечников ступени SDB-RPS промыть наконечники, добавив 150 микролитров 100% ацетонитрила и вращая буфер центрифугированием или осторожно применяя давление с помощью шприца.
Затем промыть наконечники 150 микролитрами 30% метанола, содержащего 1% TFA, затем уравновесить наконечники 150 микролитрами 90% изопропанола, содержащего 1% TFA. После уравновешивания загрузите образцы протеома на наконечники ступеней STB-RPS путем центрифугирования или с помощью шприца. Затем вымойте наконечники 150 микролитрами 90% изопропанола, содержащего 1% TFA, а затем 150 микролитров 1% TFA.
Чтобы элюировать пептиды из наконечников стадии STB-RPS, используйте 150 микролитров 5% гидроксида аммония и 80% ацетонитрила, добавленных к одному наконечнику, и соберите элюированные образцы в отдельные пробирки, осторожно применяя давление с помощью шприца. Альтернативно, при элюировании с помощью центрифугирования, используйте 150 микролитров при 5% гидроксиде аммония в 80% ацетонитриле, добавляемое ко всем наконечникам ступеней и собирающее в чистую пластину. Высушите элюированные пептиды методом вакуумного центрифугирования при температуре 25 градусов Цельсия.
Затем, чтобы обогатить образцы гликопептидов, подготовьте цвиттерионную гидрофильную хроматографию жидкого взаимодействия, или ZIC-HILIC, сценические наконечники. Вырежьте один диск C8 из мембраны C8 площадью 470 квадратных миллиметров с помощью тупой иглы 14-го калибра и упакуйте диск в наконечник P-200 для создания фрита. Затем добавьте приблизительно пять миллиметров материала ZIC-HILIC, повторно суспендированного в 50% ацетонитриле, на фрит, осторожно применяя давление с помощью шприца.
Перед использованием наконечников уравновешивайте смолу 20 объемами элюирующего буфера ZIC-HILIC, оставляя 10 микролитров объема над смолой, чтобы убедиться, что смола не высохнет. Затем последовательно промывайте смолу с 20 объемами пласта буфера подготовки ZIC-HILIC, а затем 20 объемами загрузочного или промывочного буфера ZIC-HILIC. Затем повторно суспендируют переваренные и высушенные пептиды в нагрузочном буфере ZIC-HILIC до конечной концентрации в четыре микрограмма на микролитр.
Вихрь ненадолго в течение одной минуты, чтобы убедиться, что образцы повторно суспендированы, а затем вращайте их в течение одной минуты в 2000 раз G и 25 градусов цельсия. После вращения загрузите повторно суспендированный пептидный образец на кондиционированную колонну ZIC-HILIC, затем трижды промыть колонну с 20 объемами слоя буфера нагрузки ZIC-HILIC, осторожно применяя давление с помощью шприца. Наконец, элюируют гликопептиды с 20-слойными объемами буфера элюирования ZIC-HILIC в 1,5-миллилитровую трубку, осторожно применяя давление с помощью шприца, а затем высушивают элюент вакуумным центрифугированием при 25 градусах Цельсия.
Для анализа LC-MS повторно суспендируйте образцы в буфере A* до конечной концентрации в один микрограмм на микролитр, а затем загрузите образцы на ВЭЖХ-UPLC, соединенный с MS, чтобы обеспечить разделение и идентификацию гликопептидов. Следите за сбором полученных данных MS, гарантируя, что данные собираются с желаемыми параметрами. Чтобы проанализировать образцы, обогащенные протеомом и гликопептидами, откройте FragPipe и перейдите на вкладку Рабочий процесс.
В раскрывающемся меню Рабочий процесс выберите параметр Открыть поиск и нажмите кнопку Добавить файлы, чтобы импортировать файлы данных для поиска во FragPipe. Затем перейдите на вкладку База данных, а затем Загрузить, чтобы запустить менеджер загрузок для загрузки протеомных баз данных из UniProt с использованием номера присоединения UniProt. В диспетчере загрузки выберите опцию Добавить приманки и загрязняющие вещества, чтобы включить белки приманки и загрязняющие вещества в эту базу данных.
Затем перейдите на вкладку MSFragger, затем в поле Пиковое сопоставление увеличьте допуск массы предшественника с 500 дальтон по умолчанию до 2 000 дальтон, чтобы определить большие изменения. Перейдите на вкладку Выполнить, чтобы определить расположение выходных данных FragPipe, затем нажмите кнопку Выполнить, чтобы начать поиск. При назначении гликопептидов с высокой степенью достоверности идентифицируйте часто наблюдаемые гликан-ассоциированные ионы для улучшения идентификации гликопептидов.
Затем перейдите на вкладку MSFragger и добавьте определенные дельта-массы наблюдаемых гликанов в разделы Переменные модификации и Смещения массы с отдельными массами, разделенными косой чертой. Затем добавьте гликаноассоциированные массы фрагментов этих гликанов в раздел Glyco/Labile Mods MSFragger. Наконец, загрузите все данные о рассеянном склерозе, связанные с протеомными исследованиями, в централизованные протеомные хранилища, такие как репозитории PRIDE или MassIVE.
Открытые поиски штамма Acinetobacter baumannii AB307-0294 выявили две доминирующие дельта-массы, соответствующие 648,25 и 692,28 дальтонам. Известно, что капсула ACICU состоит из тетрасахаридной К-единицы, соответствующей прогнозируемой массе 843,31 дальтона. Эта структура капсулы согласуется с наиболее часто наблюдаемой дельта-массой в пределах ACICU.
Открытый поисковый анализ штамма D1279779 выявил наличие множественных дельта-масс, согласующихся с 203,08, 794,31 и 1588,62 дальтон. С помощью интерактивного пептидного спектрального аннотатора были оценены гликопептиды, идентифицированные на трех штаммах A.baumannii, выявляющие потенциальные гликан-ассоциированные ионы. Поиски, ориентированные на гликаны, привели к заметному увеличению общего числа спектральных совпадений гликопептидов / пептидов, идентифицированных во всех трех штаммах A.baumannii, что соответствует увеличению ACICU на 37%, увеличению AB307-0294 на 117% и увеличению D1279779 на 363%.
Для отдельных событий РС включение информации, специфичной для гликана, обычно увеличивает наблюдаемую гипероценку, хотя это увеличение сильно зависит от гликана. При проведении обогащения ZIC-HILIC убедитесь, что смола всегда остается влажной, так как потеря растворителя может поставить под угрозу выделение гликопептидов. Данные о различиях в гликозилировании могут быть использованы для информирования исследований мутагенеза или выявления классов генов, ответственных за биосинтез гликанов.
Используя открытый поиск в базе данных, мы начали характеризовать разнообразие гликанов среди бактериальных родов. Это показало, что бактериальное гликозилирование является более распространенным и гораздо более разнообразным, чем мы когда-то думали.
