Bu protokol, bakteriyel glikop% eptidlerin tanımlanmasını kolaylaştırarak, araştırmacıların yeni glikozilasyon olaylarını ve ayrıca suşlar arasındaki glikozilasyon için kullanılan glikanlardaki farklılıkları tanımlamalarını sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, glikozilasyon dışı uzmanların bakteriyel proteom numunelerindeki potansiyel glikozilasyon olaylarını tanımlamalarını sağlamasıdır. Açık arama, sadece glikozilasyon değil, bir dizi modifikasyonun tanımlanması için kullanılabilecek ve herhangi bir proteom örneğine uygulanabilecek genel olarak uygulanabilir bir yaklaşımdır.
STB-RPS dur-kalk ekstraksiyon uçlarını hazırlamak için, 50 mikrogram peptit bağlamak üzere 47 milimetrelik STB-RPS membranından üç STB-RPS diskini çıkarmak üzere 14 gauge künt iğne kullanın. Daha büyük peptit miktarları için, buna göre disk sayısını artırın. SDB-RPS aşama uçlarını kullanmadan önce, 150 mikrolitre %100 asetonitril ekleyerek ve tamponu santrifüjleme veya bir şırınga kullanarak nazikçe basınç uygulayarak döndürerek uçları yıkayın.
Daha sonra, uçları% 1 TFA içeren 150 mikrolitre% 30 metanol ile yıkayın, ardından% 1 TFA içeren 150 mikrolitre% 90 izopropanol ile dengeleyin. Dengelemeden sonra, proteom numunelerini santrifüjleme veya bir şırınga kullanarak STB-RPS aşama uçlarına yükleyin. Daha sonra, uçları% 1 TFA içeren 150 mikrolitre% 90 izopropanol ve ardından 150 mikrolitre% 1 TFA ile yıkayın.
Peptitleri STB-RPS aşama uçlarından çıkarmak için, tek bir uca ilave edilmiş 150 mikrolitre% 5 amonyum hidroksit ve% 80 asetonitril kullanın ve bir şırınga kullanarak yavaşça basınç uygulayarak salınan numuneleri ayrı tüplerde toplayın. Alternatif olarak, santrifüjleme yoluyla salınıyorsa, tüm aşama uçlarına eklenen% 80 asetonitril içinde% 5 amonyum hidroksitte 150 mikrolitre kullanın ve temiz bir plakada toplayın. Salınımlı peptitleri 25 santigrat derecede vakum santrifüjleme ile kurutun.
Daha sonra, glikopeptid örneklerini zenginleştirmek için, bir zwitterionic hidrofilik etkileşim sıvı kromatografisi veya ZIC-HILIC, aşama uçları hazırlayın. 14 gauge künt iğne kullanarak 470 milimetre karelik bir C8 membrandan bir C8 diski çıkarın ve bir frit oluşturmak için diski bir P-200 ucuna paketleyin. Daha sonra,% 50 asetonitril içinde yeniden askıya alınmış yaklaşık beş milimetre ZIC-HILIC malzemesini, bir şırınga kullanarak hafifçe basınç uygulayarak frit üzerine ekleyin.
Uçları kullanmadan önce, reçineyi 20 yatak hacimli ZIC-HILIC elüsyon tamponu ile dengeleyin ve reçinenin kurumamasını sağlamak için reçinenin üzerinde 10 mikrolitre hacim bırakın. Daha sonra, reçineyi sırayla 20 yatak hacimli ZIC-HILIC hazırlama tamponu ve ardından 20 yatak hacimli ZIC-HILIC yükleme veya yıkama tamponu ile yıkayın. Daha sonra, ZIC-HILIC yükleme tamponundaki sindirilmiş ve kurutulmuş peptitleri, mikrolitre başına dört mikrogramlık son bir konsantrasyona kadar askıya alın.
Numunelerin yeniden askıya alındığından emin olmak için bir dakika boyunca kısaca vorteks yapın, ardından 2000 kez G ve 25 santigrat derecede bir dakika döndürün. Eğirdikten sonra, yeniden askıya alınmış peptit numunesini şartlandırılmış ZIC-HILIC kolonuna yükleyin, ardından bir şırınga kullanarak hafifçe basınç uygulayarak kolonu 20 yatak hacimli ZIC-HILIC yükleme tamponu ile üç kez yıkayın. Son olarak, glikopeptidleri 20 yatak hacimli ZIC-HILIC elüsyon tamponu ile 1.5 mililitrelik bir tüpe bir şırınga kullanarak hafifçe basınç uygulayarak süzün, ardından elüenti 25 santigrat derecede vakum santrifüjleme ile kurutun.
LC-MS analizi için, Tampon A*'daki numuneleri mikrolitre başına bir mikrogramlık son konsantrasyona kadar yeniden askıya alın, ardından glikopeptitlerlerin ayrılmasını ve tanımlanmasını sağlamak için numuneleri bir MS'e bağlı bir HPLC-UPLC üzerine yükleyin. Elde edilen MS veri toplamayı izleyin ve verilerin istenen parametrelerle toplandığından emin olun. Proteom ve glikopeptid ile zenginleştirilmiş numuneleri analiz etmek için FragPipe'ı açın ve İş Akışı sekmesine tıklayın.
İş akışı açılır menüsünden, Aramayı aç seçeneğini belirleyin ve aranacak veri dosyalarını FragPipe'a aktarmak için Dosya ekle'yi tıklatın. Ardından, bir UniProt katılım numarası kullanarak proteome veritabanlarını UniProt'tan indirmek üzere indirme yöneticisini başlatmak için Veritabanı sekmesine ve ardından İndir'e tıklayın. İndirme yöneticisinde, aldatıcı ve kirletici proteinleri bu veritabanına dahil etmek için Tuzaklar ve kirleticiler ekle seçeneğini tıklatın.
Ardından, MSFragger sekmesini tıklatın, ardından Tepe Eşleştirme kutusunda, büyük değişiklikleri tanımlamak için Öncü kütle toleransını varsayılan 500 daltondan 2.000 daltona yükseltin. FragPipe çıktılarının konumunu tanımlamak için Çalıştır sekmesini tıklayın, ardından aramaya başlamak için Çalıştır düğmesine tıklayın. Yüksek güvenilirliğe sahip glikopeptidler atandığında, glikopeptidlerin tanımlanmasını iyileştirmek için yaygın olarak gözlenen glikan ile ilişkili iyonları tanımlayın.
Ardından, MSFragger sekmesine tıklayın ve gözlemlenen glikanların belirlenen delta kütlelerini, tek tek kütleleri eğik çizgiyle ayrılmış Değişken modifikasyonlar ve Kütle ofsetleri bölümlerine ekleyin. Daha sonra, bu glikanların glikanla ilişkili fragman kütlelerini MSFragger'ın Gliko / Labil Modları bölümüne ekleyin. Son olarak, proteomik çalışmalarla ilişkili tüm MS verilerini PRIDE veya MassIVE depoları gibi merkezi proteomik depolara yükleyin.
Acinetobacter baumannii suşu AB307-0294'ün açık araştırması, 648.25 ve 692.28 daltonlarına karşılık gelen iki baskın delta kütlesi ortaya çıkardı. ACICU kapsülünün, 843.31 daltonluk öngörülen bir kütleye karşılık gelen bir tetrasakkarit K biriminden oluştuğu bilinmektedir. Bu kapsül yapısı, ACICU içinde en sık gözlenen delta kütlesi ile tutarlıdır.
D1279779 suşunun açık arama analizi, 203.08, 794.31 ve 1588.62 dalton ile tutarlı çoklu delta kütlelerinin varlığını ortaya koymuştur. İnteraktif peptid spektral annotatörü kullanılarak, üç A.baumannii suşunda tanımlanan glikopeptitler, potansiyel glikan ile ilişkili iyonları ortaya çıkararak değerlendirildi. Glikan odaklı aramalar, ACICU'da% 37'lik bir artışa, AB307-0294'te% 117'lik bir artışa ve D1279779'da% 363'lük bir artışa karşılık gelen üç A.baumannii suşunun hepsinde tanımlanan toplam glikopeptid / peptid spektral eşleşme sayısında kayda değer bir artışa yol açmıştır.
Bireysel MS olayları için, glikan-spesifik bilgilerin dahil edilmesi tipik olarak gözlenen Hiperskoru arttırır, ancak bu artış yüksek oranda glikana bağımlıdır. ZIC-HILIC zenginleştirme işlemini gerçekleştirirken, reçinenin her zaman ıslak kalmasını sağlayın, çünkü çözücü kaybı glikopeptitlerlerin izolasyonunu tehlikeye atabilir. Glikozilasyondaki farklılıklarla ilgili veriler, mutagenez çalışmalarını bilgilendirmek veya glikan biyosentezinden sorumlu gen sınıflarını tanımlamak için kullanılabilir.
Açık veritabanı aramasını kullanarak, bakteri cinsleri arasında glikan çeşitliliğini karakterize etmeye başladık. Bu, bakteriyel glikozilasyonun bir zamanlar düşündüğümüzden hem daha yaygın hem de çok daha çeşitli olduğunu göstermiştir.
