يوفر البروتوكول خلايا بطانية تكاثرية عالية التكاثر يمكن استخدامها في هندسة الأنسجة المختلفة والعلاج بالخلايا وتحقيقات نمذجة الأمراض. تنتج هذه التقنية باستمرار العديد من الخلايا من سحب دم واحد. لكي تنجح هذه التقنية ، من الضروري إدخال الخلايا بسرعة في وسط الثقافة وبيئة الحاضنة في أسرع وقت ممكن.
أولا ، قم بتخفيف محلول الهيبارين إلى 100 وحدة لكل ملليلتر في محلول ملحي معقم. أضف ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من محلول الهيبارين إلى كل من أنبوبين مخروطيين سعة 50 ملليلترا وحقنتين سعة 60 ملليلتر. ثم ، اسحب 1،000 وحدة غير مخففة لكل محلول هيبارين ملليلتر في أنبوب تمديد.
قم بتوصيل إبرة قياس 19 بأحد طرفي أنبوب التمديد المملوء بالهيبارين ، ومحقنة تحتوي على الهيبارين سعة 60 ملليلتر بالطرف الآخر من أنبوب التمديد. بعد ذلك ، قم بتنظيف منطقة الفخذ الفخذي من خنزير مخدر بمحلول فرك Betadin. ثقب الوريد الفخذي أو الشريان بإبرة قياس 19 وعند واحد إلى ملليلتر في الثانية ، اسحب ببطء 50 ملليلتر من الدم إلى المحقنة.
ترك الإبرة في مكانها ، قم على الفور بربط أنبوب التمديد وفصل المحقنة 60 ملليلتر. نقل الدم ببطء إلى أنبوب مخروطي يحتوي على الهيبارين 50 ملليلتر. قم بتغطية الأنبوب المخروطي بإحكام ، واقلب الأنبوب برفق عدة مرات للخلط ، وضعه على الثلج.
قم بتوصيل المحقنة المتبقية المحتوية على الهيبارين سعة 60 ملليلتر بأنبوب التمديد. قم بفك أنبوب التمديد ، واسحب ببطء 50 ملليلترا إضافيا من الدم إلى المحقنة. قم بإزالة الإبرة على الفور من الشريان أو الوريد واسحب الدم المتبقي ببطء من أنبوب التمديد إلى المحقنة.
افصل المحقنة التي يبلغ سعتها 60 ملليلترا عن أنبوب التمديد وانقل الدم ببطء إلى الأنبوب المخروطي المتبقي المحتوي على الهيبارين سعة 50 ملليلتر. قم بتغطية الأنبوب المخروطي سعة 50 ملليلتر بإحكام ، ثم قلبه برفق عدة مرات للخلط ، وضعه على الثلج. تطبيق الارقاء الضغط على منطقة الفخذ الخنزير.
تمييع الدم واحد لواحد مع برنامج تلفزيوني في أربعة أنابيب مخروطية 50 ملليلتر. أضف 25 ملليلترا من درجة حرارة الغرفة ، محلول تدرج الكثافة الجاهز للاستخدام إلى ثمانية أنابيب مخروطية سعة 50 ملليلتر. ماصة ببطء 25 ملليلتر من محلول ملحي الدم داخل كل أنبوب مخروطي 50 ملليلتر يحتوي على محلول تدرج الكثافة عن طريق تثبيت الأنبوب بزاوية حادة على طرف الماصة.
أجهزة الطرد المركزي الأنابيب لمدة 30 دقيقة في 560 غرام ودرجة حرارة الغرفة. اجمع بعناية معطف بافي ، وهو الطبقة الغائمة للخلايا أحادية النواة فوق محلول تدرج الكثافة وأسفل البلازما الصافية ، من كل أنبوب مع ماصة رقيقة ووزعها بالتساوي في أنبوبين مخروطيين جديدين سعة 50 ملليلتر. تخلص من محلول تدرج الكثافة الذي يحتوي على أنابيب.
لطلاء صفيحة من ستة آبار مع الفبرونيكتين ، اصنع محلول مخزون من فبرونيكتين البلازما البشرية عن طريق تخفيفه إلى ملليغرام واحد لكل ملليلتر في الماء المعقم. اصنع 3.6 ملليلتر من محلول عامل من الفبرونيكتين عن طريق تخفيف 600 ميكرولتر من محلول مخزون الفبرونيكتين في ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. انقل 600 ميكرولتر من محلول عمل الفبرونيكتين إلى كل بئر من صفيحة من ستة آبار واهزها برفق حتى تغطى بالتساوي.
واستنشاق الحل بلطف من كل بئر. لغسل الخلايا أحادية النواة أثناء انتظار طبقة الفبرونيكتين ، قم بتعبئة الأنابيب بما يصل إلى 45 ملليلتر من PBS ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 560 × جم وأربع درجات مئوية مع استراحة منخفضة. نضح الطافي من كلا الأنبوبين.
أعد تعليق كل خلية بيليه في 25 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. أعد تعليق كل حبيبة خلية في خمسة ملليلتر من PBS وأضف 15 ملليلتر من محلول كلوريد الأمونيوم 0.8٪ إلى كل أنبوب. اغسل الخلايا كما كان من قبل بإضافة برنامج تلفزيوني.
نضح الطافي من كلا الأنبوبين. أعد تعليق كل خلية بيليه في 25 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. أعد تعليق كل حبيبة خلوية في ستة ملليلتر من وسط زراعة EGM-2 المكمل بمحلول 10٪ FBS و 1X مضاد حيوي مضاد للفطريات.
انقل برفق ملليلتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من الصفيحة السداسية المطلية بالفبرونيكتين والصقها برفق حتى تغطى بالتساوي. بعد 24 ساعة من بذر الخلايا ، أضف برفق ملليلتر واحد من وسط الثقافة الطازجة إلى كل بئر. في اليوم التالي ، قم بشفط 1.5 ملليلتر من وسط الاستزراع برفق من كل بئر ، واستبدله ب 1.5 ملليلتر من وسط الاستزراع الطازج.
خلال الأيام الخمسة التالية ، قم بتغيير وسط الاستزراع برفق باستخدام ملليلتر من وسط الاستزراع الطازج لكل بئر. تصور بانتظام ثقافات الخلايا تحت المجهر الضوئي الموضوعي 4X منخفض الطاقة. لوحظ مورفولوجيا الخلايا المستزرعة منذ بداية الثقافة حتى لوحظت مستعمرات BOEC.
بدأت مجموعة أصغر من الخلايا الملتصقة في الالتصاق بأطباق الاستزراع والنمو ، بينما تمت إزالة الخلايا غير الملتصقة مع تغييرات متوسطة في الثقافة. ظهرت المستعمرات لأول مرة في اليوم السادس كمجموعة من الخلايا الشبيهة بالبطانة تتكاثر شعاعيا إلى الخارج من نقطة مركزية. مع تقدم الثقافة ، أصبحت مستعمرات الخلايا أكثر كثافة وعرضت مورفولوجيا مرصوفة بالحصى مماثلة للخلايا البطانية الناضجة.
تم استخدام مجهر تباين الطور ثنائي الأبعاد لتشكيل أنبوب الصورة في وسط خال من المصل ووسط نمو كامل. خضعت الخلايا في كلتا الحالتين الوسيطتين للتمايز المورفولوجي وسرعان ما تم تنظيمها في شبكات واسعة من الهياكل الشبيهة بالأنبوب الشعري. تميزت BOECs أيضا بالتعبير عن علامة الخلايا البطانية الناضجة CD31 أو جزيء التصاق الخلايا البطانية للصفائح الدموية واحد.
أظهرت BOECs تعبيرا موحدا عن CD31. علاوة على ذلك ، أكد تحليل قياس التدفق الخلوي ل BOECs مع الجسم المضاد CD14 AF 700 مقارنة بالتحكم الإيجابي عدم وجود EPCs ، حيث أن الخلية ملطخة سلبية لعلامة الوحيدات CD14 مقارنة بمجموعة التحكم الإيجابية ل PBMCs. يظهر تلطيخ CD14 الإيجابي باللون الأزرق ، والخلايا غير الملوثة الموضحة باللون الأحمر.
أثناء جمع الدم ، من الضروري جمع أكبر قدر ممكن من طبقة معطف بافي أثناء جمع أقل قدر ممكن من الطبقات المجاورة. مكنت هذه التقنية الباحثين من دراسة استراتيجيات جديدة لبطانة أجهزة القلب والأوعية الدموية القابلة للزرع باستخدام نموذج خنزير مع خلايا بطانية ذاتية النمو للدم.
