Das Protokoll bietet hochproliferative Endothelzellen des Blutwachstums, die für verschiedene Untersuchungen in den Bereichen Gewebezüchtung, Zelltherapie und Krankheitsmodellierung verwendet werden können. Diese Technik liefert konsistent viele Zellen aus einer einzigen Blutabnahme. Damit diese Technik erfolgreich ist, ist es entscheidend, die Zellen so schnell wie möglich in das Nährmedium und die Inkubatorumgebung zu bringen.
Verdünnen Sie zunächst die Heparinlösung auf 100 Einheiten pro Milliliter in steriler Kochsalzlösung. Geben Sie drei bis vier Milliliter Heparinlösung in zwei konische 50-Milliliter-Röhrchen und zwei 60-Milliliter-Spritzen. Ziehen Sie dann unverdünnt 1.000 Einheiten pro Milliliter Heparinlösung in ein Verlängerungsröhrchen.
Schließen Sie eine 19-Gauge-Nadel an ein Ende des mit Heparin gefüllten Verlängerungsröhrchens und eine Heparin-haltige 60-Milliliter-Spritze an das andere Ende des Verlängerungsröhrchens an. Als nächstes reinigen Sie die Oberschenkelleiste eines anästhesierten Schweins mit einer Betadine-Peelinglösung. Punktieren Sie die Oberschenkelvene oder -arterie mit einer 19-Gauge-Nadel und saugen Sie mit ein bis zwei Millilitern pro Sekunde langsam 50 Milliliter Blut in die Spritze.
Lassen Sie die Nadel an Ort und Stelle, knicken Sie sofort den Verlängerungsschlauch und trennen Sie die 60-Milliliter-Spritze. Das Blut wird langsam in ein heparinhaltiges konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt. Verschließen Sie das konische Röhrchen fest, drehen Sie das Röhrchen zum Mischen einige Male vorsichtig um und legen Sie es auf Eis.
Schließen Sie die verbleibende Heparin-haltige 60-Milliliter-Spritze an das Verlängerungsröhrchen an. Öffnen Sie den Verlängerungsschlauch und ziehen Sie langsam weitere 50 Milliliter Blut in die Spritze. Entfernen Sie sofort die Nadel aus der Arterie oder Vene und saugen Sie langsam das restliche Blut aus dem Verlängerungsschlauch in die Spritze.
Trennen Sie die 60-Milliliter-Spritze vom Verlängerungsschlauch und übertragen Sie das Blut langsam in den verbleibenden heparinhaltigen 50-Milliliter-Konusschlauch. Verschließen Sie das konische 50-Milliliter-Röhrchen fest, drehen Sie es zum Mischen einige Male vorsichtig um und legen Sie es auf Eis. Üben Sie eine Druckhämostase auf die Oberschenkelleistengegend des Schweins aus.
Verdünnen Sie das Blut eins zu eins mit PBS in vier konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 25 Milliliter gebrauchsfertige Dichtegradientenlösung bei Raumtemperatur in acht konische 50-Milliliter-Röhrchen. Pipettieren Sie langsam 25 Milliliter Blutkochsalzlösung in jedes konische 50-Milliliter-Röhrchen, das die Dichtegradientenlösung enthält, indem Sie das Röhrchen in einem spitzen Winkel zur Pipettenspitze halten.
Zentrifugieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei 560 g und Raumtemperatur. Sammeln Sie den Buffy-Mantel, die trübe Schicht aus mononukleären Zellen über der Dichtegradientenlösung und unter dem klaren Plasma, vorsichtig mit einer dünnen Pipette aus jedem Röhrchen und verteilen Sie ihn gleichmäßig auf zwei neue konische 50-Milliliter-Röhrchen. Verwerfen Sie die Dichtegradientenlösung, die Rohre enthält.
Um eine Sechs-Well-Platte mit Fibronektin zu beschichten, stellen Sie eine Stammlösung von humanem Plasma-Fibronektin her, indem Sie es in sterilem Wasser auf ein Milligramm pro Milliliter verdünnen. Stellen Sie 3,6 Milliliter einer Arbeitslösung von Fibronektin her, indem Sie 600 Mikroliter Fibronektin-Stammlösung in drei Millilitern PBS verdünnen. Übertragen Sie 600 Mikroliter der Fibronektin-Arbeitslösung in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte und schütteln Sie sie vorsichtig, bis sie gleichmäßig bedeckt ist.
Und saugen Sie die Lösung vorsichtig aus jeder Vertiefung ab. Um die mononukleären Zellen zu waschen, während Sie darauf warten, dass das Fibronektin beschichtet wird, füllen Sie die Röhrchen mit bis zu 45 Millilitern PBS auf und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 560 x g und vier Grad Celsius mit geringer Pause. Saugen Sie den Überstand aus beiden Röhrchen ab.
Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 25 Millilitern PBS. Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in fünf Milliliter PBS und geben Sie 15 Milliliter 0,8%ige Ammoniumchloridlösung in jedes Röhrchen. Waschen Sie die Zellen wie zuvor, indem Sie PBS hinzufügen.
Saugen Sie den Überstand aus beiden Röhrchen ab. Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 25 Millilitern PBS. Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in sechs Millilitern EGM-2-Nährmedium, ergänzt mit 10 % FBS und 1-facher antibiotisch-antimykotischer Lösung.
Übertragen Sie vorsichtig zwei Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung der mit Fibronektin beschichteten Sechs-Well-Platte und schütteln Sie sie vorsichtig, bis sie gleichmäßig bedeckt ist. 24 Stunden nach der Aussaat der Zellen geben Sie vorsichtig einen Milliliter frisches Nährmedium in jede Vertiefung. Saugen Sie am nächsten Tag vorsichtig 1,5 Milliliter Nährmedium aus jeder Vertiefung ab und ersetzen Sie es durch 1,5 Milliliter frisches Nährmedium.
Wechseln Sie das Nährmedium in den nächsten fünf Tagen vorsichtig mit zwei Millilitern frischem Nährmedium pro Vertiefung. Visualisieren Sie die Zellkulturen regelmäßig unter 4-facher Objektivmikroskopie mit geringer Leistung. Die Morphologie der kultivierten Zellen wurde vom Beginn der Kultur bis zur Beobachtung der BOEC-Kolonien beobachtet.
Eine kleinere Population adhärenter Zellen begann sich an die Kulturschalen anzuheften und zu wachsen, während nicht-adhärente Zellen mit Nährmedienwechsel entfernt wurden. Die Kolonien erschienen zum ersten Mal am sechsten Tag als eine Ansammlung von endothelialen Zellen, die sich von einem zentralen Punkt aus radial nach außen ausbreiteten. Im Laufe der Kultur wurden die Zellkolonien dichter und zeigten eine Kopfsteinpflaster-Morphologie, die reifen Endothelzellen ähnelte.
Die zweidimensionale Phasenkontrastmikroskopie wurde verwendet, um die Röhrenbildung in serumfreiem Medium und vollständigem Wachstumsmedium abzubilden. Zellen in beiden Medienbedingungen durchliefen eine morphologische Differenzierung und organisierten sich schnell zu ausgedehnten Netzwerken von kapillarröhrenartigen Strukturen. BOECs wurden weiterhin durch die Expression des reifen Endothelzellmarkers CD31 oder des Thrombozyten-Endothelzelladhäsionsmoleküls eins charakterisiert.
BOECs zeigten eine einheitliche Expression von CD31. Darüber hinaus bestätigte die durchflusszytometrische Analyse von BOECs mit CD14 AF 700 Antikörpern im Vergleich zur Positivkontrolle das Fehlen von EPCs, da die Zelle im Vergleich zur Positivkontrollgruppe der PBMCs negativ für den Monozytenmarker CD14 gefärbt war.
Bei der Blutentnahme ist es wichtig, so viel wie möglich von der Buffy-Coat-Schicht zu sammeln und so wenig wie möglich von den angrenzenden Schichten zu sammeln. Diese Technik ermöglichte es den Forschern, neue Strategien zur Endothelisierung implantierbarer kardiovaskulärer Geräte zu untersuchen, indem sie ein Schweinemodell mit autologem Blutwachstum in Endothelzellen verwendeten.
