猪外周血血液生长内皮细胞（BOEC）的表征

该方案提供高度增殖的血液生长内皮细胞，可用于各种组织工程、细胞治疗和疾病建模研究。这种技术始终如一地从一次抽血中产生许多细胞。为了使该技术取得成功，尽快将细胞快速放入培养基和培养箱环境中至关重要。

首先，在无菌盐水中将肝素溶液稀释至每毫升100单位。向两个 50 毫升锥形管和两个 60 毫升注射器中各添加三至四毫升肝素溶液。然后，将未稀释的每毫升肝素溶液1， 000单位吸入延长管中。

将 19 号针头连接到充满肝素的延长管的一端，将含肝素的 60 毫升注射器连接到延长管的另一端。接下来，用Betadine磨砂溶液清洁麻醉猪的股骨腹股沟区域。用 19 号针刺穿股静脉或动脉，以每秒 1 到 2 毫升的速度，缓慢地将 50 毫升血液吸入注射器。

将针头留在原位，立即扭结延长管并断开 60 毫升注射器。将血液缓慢转移到含肝素的50毫升锥形管中。盖紧锥形管，轻轻倒置管几次混合，然后将其放在冰上。

将剩余的含肝素的60毫升注射器连接到延长管。解开延长管，慢慢地将额外的50毫升血液吸入注射器中。立即从动脉或静脉中取出针头，并将延长管中的剩余血液缓慢抽入注射器。

断开60毫升注射器与延长管的连接，然后将血液缓慢转移到剩余的含肝素的50毫升锥形管中。盖紧50毫升锥形管，轻轻倒置几次混合，然后放在冰上。对猪的股骨腹股沟区域施加压力止血。

用PBS在四个50毫升的锥形管中一对一稀释血液。将 25 毫升室温即用型密度梯度溶液加入八个 50 毫升锥形管中。通过将管与移液器尖端成锐角，在每个含有密度梯度溶液的50毫升锥形管内缓慢移取25毫升血盐水溶液。

将试管在560g和室温下离心30分钟。用细移液管从每个管中小心地收集血沉棕黄层，这是密度梯度溶液上方和透明血浆下方的单核细胞浑浊层，并将其均匀地分布到两个新的 50 毫升锥形管中。丢弃含有管的密度梯度溶液。

要用纤连蛋白涂覆六孔板，通过在无菌水中将其稀释至每毫升一毫克来制备人血浆纤连蛋白储备溶液。通过在三毫升PBS中稀释600微升纤连蛋白储备溶液，制成3.6毫升纤连蛋白的工作溶液。将600微升纤连蛋白工作溶液转移到六孔板的每个孔中，轻轻摇动直至均匀涂覆。

并轻轻地从每个孔中吸出溶液。要在等待纤连蛋白包被的同时清洗单核细胞，请在试管中加入多达 45 毫升的 PBS，在 560 X g 和 4 摄氏度下以低断裂离心五分钟。从两个管中吸出上清液。

将每个细胞沉淀重悬于25毫升PBS中。将每个细胞沉淀重悬于5毫升PBS中，并向每个试管中加入15毫升0.8%氯化铵溶液。像以前一样通过添加PBS清洗细胞。

从两个管中吸出上清液。将每个细胞沉淀重悬于25毫升PBS中。将每个细胞沉淀重悬于补充有10%FBS和1X抗生素 - 抗真菌溶液的6毫升EGM-2培养基中。

轻轻地将两毫升细胞悬液转移到纤连蛋白包被的六孔板的每个孔中，并轻轻摇动直至均匀包被。接种细胞24小时后，轻轻向每个孔中加入一毫升新鲜培养基。第二天，从每个孔中轻轻吸出1.5毫升培养基，并用1.5毫升新鲜培养基代替。

在接下来的五天里，用每孔两毫升新鲜培养基轻轻更换培养基。在低功率4X物镜显微镜下定期观察细胞培养物。从培养开始到观察到BOEC菌落，观察培养细胞的形态。

较小的贴壁细胞群开始附着在培养皿上并生长，而非贴壁细胞则随着培养基的变化而被移除。菌落在第六天首次出现，作为从中心点向外放射状增殖的内皮样细胞的集合。随着培养的进行，细胞集落变得更加致密，并显示出类似于成熟内皮细胞的鹅卵石形态。

二维相衬显微镜用于对无血清培养基和完全生长培养基中的管形成进行成像。两种培养基条件下的细胞都经历了形态分化，并迅速组织成广泛的毛细管状结构网络。BOECs还通过表达成熟的内皮细胞标志物CD31或血小板内皮细胞粘附分子之一来表征。

BOEC表现出CD31的均匀表达。此外，与阳性对照组相比，具有CD14 AF 700抗体的BOEC的流式细胞术分析证实了EPC的缺失，因为与PBMC的阳性对照组相比，单核细胞标志物CD14染色呈阴性。 CD14染色阳性显示为蓝色，未染色细胞显示为红色。

在采血过程中，必须收集尽可能多的血沉棕黄层，同时尽可能少地收集相邻层。该技术使研究人员能够研究使用具有自体血液生长内皮细胞的猪模型内皮化植入式心血管装置的新策略。