הפרוטוקול מספק תאי אנדותל בעלי צמיחת דם גבוהה שיכולים לשמש להנדסת רקמות שונות, תרפיה תאית וחקירות מידול מחלות. טכניקה זו מניבה באופן עקבי תאים רבים משאיבת דם אחת. כדי שטכניקה זו תצליח, חיוני להכניס במהירות את התאים למדיום התרבית ולסביבת האינקובטור בהקדם האפשרי.
ראשית, לדלל את תמיסת הפרין ל -100 יחידות למיליליטר במי מלח סטריליים. הוסף שלושה עד ארבעה מיליליטר של תמיסת הפרין לכל אחד משני צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר ושני מזרקים של 60 מיליליטר. לאחר מכן, למשוך undiluted 1, 000 יחידות לכל מיליליטר הפרין פתרון לתוך צינור הארכה.
חבר מחט 19 מד לקצה אחד של צינור ההארכה המלא בהפרין, ומזרק 60 מיליליטר המכיל הפרין לקצה השני של הצינור המאריך. לאחר מכן, נקו את אזור המפשעה הירכית של חזיר מורדם עם תמיסת קרצוף בטדין. לנקב את וריד הירך או עורק עם מחט 19 מד ב אחד עד שני מיליליטר לשנייה, לאט למשוך 50 מיליליטר של דם לתוך מזרק.
השארת המחט במקום, מיד לעקם את צינור ההארכה לנתק את מזרק 60 מיליליטר. מעבירים את הדם לאט לצינור חרוטי 50 מיליליטר המכיל הפרין. מכסים היטב את הצינור החרוט, הופכים בעדינות את הצינור כמה פעמים כדי לערבב, ומניחים אותו על קרח.
חברו את המזרק הנותר המכיל הפרין בקוטר 60 מיליליטר לצינור המאריך. שחררו את צינור ההארכה, ולאט לאט משכו דם נוסף של 50 מיליליטר לתוך המזרק. מיד להסיר את המחט מן העורק או הווריד ולאט לאט למשוך את הדם שנותר מן הצינור הרחבה לתוך מזרק.
נתקו את מזרק ה-60 מיליליטר מצינור ההארכה והעבירו באיטיות את הדם לצינור החרוטי הנותר המכיל הפרין בקוטר 50 מיליליטר. מכסים היטב את הצינור החרוטי בקוטר 50 מיליליטר, הופכים בעדינות כמה פעמים כדי לערבב, ומניחים על קרח. יש להפעיל המוסטאזיס לחץ על אזור המפשעה של עצם הירך של החזיר.
לדלל את הדם אחד על אחד עם PBS בארבעה צינורות חרוטי 50 מיליליטר. הוסף 25 מיליליטר של טמפרטורת החדר, פתרון שיפוע צפיפות מוכן לשימוש לשמונה צינורות חרוטי 50 מיליליטר. לאט פיפטה 25 מיליליטר של תמיסת מלח דם בתוך כל צינור חרוטי 50 מיליליטר המכיל תמיסת שיפוע צפיפות על ידי החזקת הצינור בזווית חדה לקצה פיפטה.
צנטריפוגה את הצינורות במשך 30 דקות ב 560 גרם ובטמפרטורת החדר. בזהירות לאסוף את מעיל באפי, שהוא השכבה העכורה של תאים מונוגרעיניים מעל פתרון שיפוע צפיפות מתחת פלזמה ברורה, מכל צינור עם פיפטה דקה ולהפיץ אותו באופן שווה לתוך שני צינורות חרוטי 50 מיליליטר חדשים. יש להשליך את תמיסת שיפוע הצפיפות המכילה צינורות.
כדי לצפות צלחת שש בארות עם פיברונקטין לעשות פתרון מלאי של פיברונקטין פלזמה אנושית על ידי דילול אותו למיליגרם אחד למיליליטר במים סטריליים. הפוך 3.6 מיליליטר של פתרון עבודה של פיברונקטין על ידי דילול 600 מיקרוליטר של תמיסת מלאי פיברונקטין בשלושה מיליליטר של PBS. מעבירים 600 מיקרוליטר של תמיסת העבודה פיברונקטין לכל באר של צלחת בעלת שש בארות ורוקדים בעדינות עד לציפוי אחיד.
ולשאוף בעדינות את הפתרון מכל באר. כדי לשטוף את התאים החד-גרעיניים בזמן ההמתנה לציפוי הפיברונקטין יש למלא את הצינורות בעד 45 מיליליטר PBS, צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-560 X גרם וארבע מעלות צלזיוס עם הפסקה נמוכה. שאפו את הסופרנאטנט משני הצינורות.
השהה מחדש כל כדור תא ב -25 מיליליטר של PBS. יש להשהות מחדש כל כדור תא בחמישה מיליליטר PBS ולהוסיף 15 מיליליטר של תמיסת אמוניום כלוריד 0.8% לכל צינור. שטפו את התאים כמו קודם על ידי הוספת PBS.
שאפו את הסופרנאטנט משני הצינורות. השהה מחדש כל כדור תא ב -25 מיליליטר של PBS. יש להשהות מחדש כל כדורית תא בשישה מיליליטר של מדיום תרבית EGM-2 בתוספת 10% FBS ותמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית 1X.
מעבירים בעדינות שני מיליליטר מתרחיף התא לכל באר של צלחת שש בארות מצופות פיברונקטין ומנערים בעדינות עד לציפוי אחיד. 24 שעות לאחר זריעת התאים, הוסיפו בעדינות מיליליטר אחד של מדיום תרבית טרי לכל באר. למחרת, שאפו בעדינות 1.5 מיליליטר של מדיום תרבית מכל באר, והחליפו אותו ב-1.5 מיליליטר של מדיום תרבית טרי.
במשך חמשת הימים הבאים, החליפו בעדינות את מדיום התרבות עם שני מיליליטר של מדיום תרבית טרי לכל באר. דמיינו באופן קבוע את תרביות התאים תחת מיקרוסקופ אור אובייקטיבי 4X בהספק נמוך. המורפולוגיה של התאים בתרבית נצפתה מתחילת התרבית ועד שנצפו מושבות BOEC.
אוכלוסייה קטנה יותר של תאים דבקים החלה להיצמד לצלחות התרבית ולגדול, בעוד תאים שאינם דבקים הוסרו עם שינויים במדיום התרבית. מושבות הופיעו לראשונה ביום השישי כאוסף של תאים דמויי אנדותל המתרבים רדיאלית החוצה מנקודה מרכזית. ככל שהתקדמה התרבית, מושבות התאים נעשו צפופות יותר והציגו מורפולוגיה מרוצפת הדומה לתאי אנדותל בוגרים.
מיקרוסקופ ניגודיות פאזה דו-ממדי שימש להדמיה של היווצרות צינוריות בתווך נטול סרום ובמדיום צמיחה מלא. תאים בשני תנאי המדיה עברו התמיינות מורפולוגית והתארגנו במהירות ברשתות נרחבות של מבנים דמויי צינור נימי. BOECs אופיינו גם על ידי ביטוי של סמן תאי אנדותל בוגר CD31 או מולקולת הידבקות תאי אנדותל טסיות 1.
BOECs הראו ביטוי אחיד של CD31. יתר על כן, ניתוח ציטומטריית זרימה של BOECs עם נוגדן CD14 AF 700 בהשוואה לביקורת חיובית אישר את היעדר EPC, שכן התא מוכתם שלילי עבור סמן מונוציטים CD14 בהשוואה לקבוצת הביקורת החיובית של PBMCs. צביעת CD14 חיובית מוצגת בכחול, ותאים לא מוכתמים מוצגים באדום.
במהלך איסוף הדם, חיוני לאסוף כמה שיותר משכבת הפרווה האפי תוך איסוף כמה שפחות מהשכבות הסמוכות. טכניקה זו אפשרה לחוקרים לחקור אסטרטגיות חדשות לאנדותל התקנים קרדיווסקולריים מושתלים באמצעות מודל חזיר עם תאי אנדותל אוטולוגיים של צמיחת דם.
