Protokol, çeşitli doku mühendisliği, hücre tedavisi ve hastalık modelleme araştırmaları için kullanılabilecek oldukça proliferatif kan büyümesi endotel hücreleri sağlar. Bu teknik, tek bir kan alımından sürekli olarak birçok hücre verir. Bu tekniğin başarılı olması için, hücrelerin mümkün olan en kısa sürede kültür ortamına ve inkübatör ortamına hızlı bir şekilde sokulması çok önemlidir.
İlk olarak, heparin çözeltisini steril salin içinde mililitre başına 100 birime seyreltin. İki adet 50 mililitrelik konik tüpün ve iki adet 60 mililitrelik şırınganın her birine üç ila dört mililitre heparin çözeltisi ekleyin. Daha sonra, mililitre heparin çözeltisi başına seyreltilmemiş 1.000 üniteyi bir uzatma tüpüne çekin.
Heparin dolgulu uzatma tüpünün bir ucuna 19 gauge iğne ve uzatma tüpünün diğer ucuna heparin içeren 60 mililitrelik bir şırınga bağlayın. Daha sonra, anestezi uygulanmış bir domuzun femoral kasık bölgesini bir Betadine ovma çözeltisi ile temizleyin. Femoral veni veya arteri 19 gauge iğne ile delin ve saniyede bir ila iki mililitrede, şırıngaya yavaşça 50 mililitre kan çekin.
İğneyi yerinde bırakarak, hemen uzatma tüpünü bükün ve 60 mililitrelik şırınganın bağlantısını kesin. Kanı yavaşça heparin içeren 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın. Konik tüpü sıkıca kapatın, karıştırmak için tüpü birkaç kez yavaşça ters çevirin ve buzun üzerine yerleştirin.
Kalan heparin içeren 60 mililitrelik şırıngayı uzatma tüpüne bağlayın. Uzatma tüpünü çıkarın ve yavaşça şırıngaya 50 mililitre daha kan çekin. İğneyi derhal arterden veya damardan çıkarın ve kalan kanı uzatma tüpünden yavaşça şırıngaya çekin.
60 mililitrelik şırıngayı uzatma tüpünden ayırın ve kanı yavaşça kalan heparin içeren 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. 50 mililitrelik konik tüpü sıkıca kapatın, karıştırmak için birkaç kez hafifçe ters çevirin ve buzun üzerine yerleştirin. Domuzun femoral kasık bölgesine basınç hemostazı uygulayın.
Kanı PBS ile dört adet 50 mililitrelik konik tüpte bire bir seyreltin. Sekiz adet 50 mililitrelik konik tüpe 25 mililitre oda sıcaklığı, kullanıma hazır yoğunluk gradyanı çözeltisi ekleyin. Yavaşça pipet içine 25 mililitre kan salin çözeltisi içeren her 50 mililitrelik konik tüpün içine yoğunluk gradyanı çözeltisi ekleyerek tüpü pipet ucuna keskin bir açıyla tutun.
Tüpleri 560 g ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca santrifüj edin. Yoğunluk gradyanı çözeltisinin üstünde ve berrak plazmanın altındaki mononükleer hücrelerin bulutlu tabakası olan kabarık katı, ince bir pipetle her tüpten dikkatlice toplayın ve iki yeni 50 mililitrelik konik tüpe eşit olarak dağıtın. Tüpleri içeren yoğunluk gradyanı çözeltisini atın.
Altı delikli bir plakayı fibronektin ile kaplamak için, steril suda mililitre başına bir miligrama seyrelterek insan plazma fibronektinin stok çözeltisini yapın. Üç mililitre PBS'de 600 mikrolitre fibronektin stok çözeltisini seyrelterek 3.6 mililitre çalışan bir fibronektin çözeltisi yapın. 600 mikrolitre fibronektin çalışma çözeltisini altı delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın ve eşit şekilde kaplanana kadar hafifçe sallayın.
Ve çözeltiyi her bir kuyudan nazikçe aspire edin. Fibronektinin kaplanmasını beklerken mononükleer hücreleri yıkamak için, tüpleri 45 mililitreye kadar PBS ile doldurun, 560 X g'de beş dakika santrifüj yapın ve düşük mola ile dört santigrat derece. Süpernatantı her iki tüpten de aspire edin.
Her hücre peletini 25 mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Her hücre peletini beş mililitre PBS içinde yeniden askıya alın ve her tüpe 15 mililitre% 0.8 amonyum klorür çözeltisi ekleyin. PBS ekleyerek hücreleri daha önce olduğu gibi yıkayın.
Süpernatantı her iki tüpten de aspire edin. Her hücre peletini 25 mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Her hücre peletini,% 10 FBS ve 1X antibiyotik-antimikotik çözelti ile desteklenmiş altı mililitre EGM-2 kültür ortamında tekrar askıya alın.
Hücre süspansiyonunun iki mililitresini, fibronektin kaplı altı delikli plakanın her bir kuyucuğuna yavaşça aktarın ve eşit şekilde kaplanana kadar hafifçe sallayın. Hücreleri tohumladıktan 24 saat sonra, her bir oyuğa yavaşça bir mililitre taze kültür ortamı ekleyin. Ertesi gün, her bir kuyudan 1,5 mililitre kültür ortamını nazikçe aspire edin ve 1,5 mililitre taze kültür ortamı ile değiştirin.
Önümüzdeki beş gün boyunca, kültür ortamını kuyu başına iki mililitre taze kültür ortamı ile yavaşça değiştirin. Düşük güçlü 4X objektif ışık mikroskobu altında hücre kültürlerini düzenli olarak görselleştirin. Kültürlenmiş hücrelerin morfolojisi, kültürün başlangıcından BOEC kolonileri gözlenene kadar gözlendi.
Daha küçük bir yapışkan hücre popülasyonu kültür yemeklerine bağlanmaya ve büyümeye başlarken, yapışkan olmayan hücreler kültür ortamı değişiklikleriyle uzaklaştırıldı. Koloniler ilk olarak altıncı günde, merkezi bir noktadan radyal olarak dışa doğru çoğalan endotel benzeri hücrelerin bir koleksiyonu olarak ortaya çıktı. Kültür ilerledikçe, hücre kolonileri daha yoğun hale geldi ve olgun endotel hücrelerine benzer bir parke taşı morfolojisi sergiledi.
Serumsuz ortamda ve tam büyüme ortamında tüp oluşumunu görüntülemek için iki boyutlu faz kontrast mikroskobu kullanıldı. Her iki ortam koşullarındaki hücreler morfolojik farklılaşmaya uğradı ve hızla kılcal tüp benzeri yapıların geniş ağlarına organize oldu. BOEC'ler ayrıca olgun endotel hücre belirteci CD31 veya trombosit endotel hücre adezyon molekülü bir'in ekspresyonu ile karakterize edildi.
BOEC'ler CD31'in tekdüze ekspresyonunu gösterdi. Ayrıca, CD14 AF 700 antikoru ile BOEC'lerin pozitif kontrole kıyasla akış sitometri analizi, PBMC'lerin pozitif kontrol grubuna kıyasla monosit belirteci CD14 için negatif boyandığı için EPC'lerin yokluğunu doğruladı.
Kan toplama sırasında, bitişik katmanların mümkün olduğunca azını toplarken, buffy ceket tabakasının mümkün olduğunca çoğunu toplamak önemlidir. Bu teknik, araştırmacıların otolog kan büyümesi endotel hücrelerine sahip bir domuz modeli kullanarak implante edilebilir kardiyovasküler cihazları endotelalize etmek için yeni stratejiler incelemelerini sağlamıştır.
