Протокол обеспечивает высокопролиферативные эндотелиальные клетки кроветворения, которые могут быть использованы для различных исследований в области тканевой инженерии, клеточной терапии и моделирования заболеваний. Этот метод последовательно дает много клеток из одного забора крови. Чтобы этот метод был успешным, крайне важно как можно скорее доставить клетки в питательную среду и среду инкубатора.
Сначала раствор гепарина разводят до 100 единиц на миллилитр в стерильном физиологическом растворе. Добавьте три-четыре миллилитра раствора гепарина в каждую из двух 50-миллилитровых конических трубок и двух 60-миллилитровых шприцев. Затем наберите неразбавленный раствор гепарина 1 000 единиц на миллилитр в удлинительную трубку.
Подсоедините иглу 19-го калибра к одному концу удлинительной трубки, заполненной гепарином, и шприц, содержащий гепарин, 60 миллилитров, к другому концу удлинительной трубки. Затем очистите бедренную паховую область обезболиваемой свиньи раствором скраба Бетадин. Проколите бедренную вену или артерию иглой 19-го калибра и со скоростью от одного до двух миллилитров в секунду медленно наберите в шприц 50 миллилитров крови.
Оставив иглу на месте, сразу же перегибаем удлинительную трубку и отсоединяем шприц объемом 60 миллилитров. Медленно переведите кровь в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую гепарин. Плотно закройте коническую трубку, аккуратно переверните трубку несколько раз, чтобы перемешать, и положите ее на лед.
Подсоедините оставшийся 60-миллилитровый шприц, содержащий гепарин, к удлинительной трубке. Разомните удлинительную трубку и медленно наберите в шприц еще 50 миллилитров крови. Немедленно извлеките иглу из артерии или вены и медленно наберите оставшуюся кровь из удлинительной трубки в шприц.
Отсоедините 60-миллилитровый шприц от удлинительной трубки и медленно переведите кровь в оставшуюся 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую гепарин. Плотно закройте 50-миллилитровую коническую трубку, аккуратно переверните несколько раз, чтобы перемешать, и положите на лед. Нанесите прижимной гемостаз на бедренную паховую область свиньи.
Разбавьте кровь один к одному с PBS в четырех 50-миллилитровых конических трубках. Добавьте 25 миллилитров готового к использованию раствора градиента плотности комнатной температуры в восемь конических трубок по 50 миллилитров. Медленно введите 25 миллилитров физиологического раствора крови внутрь каждой 50-миллилитровой конической трубки, содержащей раствор с градиентом плотности, удерживая пробирку под острым углом к наконечнику пипетки.
Центрифугируют пробирки в течение 30 минут при 560 г и комнатной температуре. Аккуратно соберите охристую оболочку, которая представляет собой мутный слой мононуклеарных ячеек над раствором градиента плотности и ниже прозрачной плазмы, из каждой пробирки тонкой пипеткой и равномерно распределите ее по двум новым 50-миллилитровым коническим трубкам. Откажитесь от раствора градиента плотности, содержащего трубки.
Чтобы покрыть шестилуночную пластину фибронектином, сделайте исходный раствор фибронектина плазмы человека, разбавив его до одного миллиграмма на миллилитр в стерильной воде. Сделайте 3,6 миллилитра рабочего раствора фибронектина, разведя 600 микролитров исходного раствора фибронектина в трех миллилитрах PBS. Перелейте 600 микролитров рабочего раствора фибронектина в каждую лунку шестилуночной пластины и аккуратно откачайте до равномерного покрытия.
И аккуратно аспирируйте раствор из каждой лунки. Чтобы промыть мононуклеарные клетки, ожидая, пока фибронектин покроется, долейте до 45 миллилитров PBS, центрифугу в течение пяти минут при 560 X g и четырех градусах Цельсия с низким разрывом. Аспирируйте надосадочную жидкость из обеих трубок.
Ресуспендируйте каждую клеточную гранулу в 25 миллилитрах PBS. Ресуспендируйте каждую клеточную гранулу в пяти миллилитрах PBS и добавьте 15 миллилитров 0,8% раствора хлорида аммония в каждую пробирку. Промойте ячейки, как и раньше, добавив PBS.
Аспирируйте надосадочную жидкость из обеих трубок. Ресуспендируйте каждую клеточную гранулу в 25 миллилитрах PBS. Ресуспендировать каждую клеточную гранулу в шести миллилитрах питательной среды EGM-2 с добавлением 10% FBS и 1X антибиотико-антимикотического раствора.
Аккуратно перенесите два миллилитра клеточной суспензии в каждую лунку шестилуночной пластины, покрытой фибронектином, и осторожно откачайте до равномерного покрытия. Через 24 часа после посева клеток аккуратно добавьте в каждую лунку по одному миллилитру свежей питательной среды. На следующий день аккуратно аспирируйте 1,5 миллилитра питательной среды из каждой лунки и замените ее 1,5 миллилитрами свежей питательной среды.
В течение следующих пяти дней аккуратно меняйте питательную среду с двумя миллилитрами свежей питательной среды на лунку. Регулярно визуализируйте клеточные культуры под микроскопией 4-кратного объектива с низким энергопотреблением. Морфология культивируемых клеток наблюдалась с самого начала культивирования до тех пор, пока не наблюдались колонии BOEC.
Меньшая популяция адгезивных клеток начала прикрепляться к культуральным чашкам и расти, в то время как неадгезивные клетки удалялись с изменением питательной среды. Колонии впервые появились на шестой день как совокупность эндотелиоподобных клеток, размножающихся радиально наружу от центральной точки. По мере развития культуры клеточные колонии становились более плотными и демонстрировали морфологию булыжника, похожую на зрелые эндотелиальные клетки.
Двумерная фазово-контрастная микроскопия была использована для формирования визуальных трубок в среде без сыворотки и полной питательной среде. Клетки в обеих средах подвергались морфологической дифференцировке и быстро организовывались в обширные сети капиллярных трубчатых структур. Кроме того, BOEC характеризовались экспрессией маркера зрелых эндотелиальных клеток CD31 или молекулы адгезии эндотелиальных клеток тромбоцитов.
BOEC показали равномерную экспрессию CD31. Кроме того, анализ проточной цитометрии BOEC с антителами CD14 AF 700 по сравнению с положительным контролем подтвердил отсутствие EPC, поскольку клетка окрашена отрицательно на моноцитарный маркер CD14 по сравнению с положительной контрольной группой PBMC. Положительное окрашивание CD14 показано синим цветом, а неокрашенные клетки показаны красным.
Во время сбора крови важно собрать как можно больше слоя охристой шерсти, собирая при этом как можно меньше соседних слоев. Этот метод позволил исследователям изучить новые стратегии эндотелизации имплантируемых сердечно-сосудистых устройств с использованием модели свиньи с аутологичными эндотелиальными клетками.
