このプロトコルは、さまざまな組織工学、細胞療法、および疾患モデリングの調査に使用できる、高度に増殖する血液伸長内皮細胞を提供します。この技術は、1回の採血から一貫して多くの細胞を生成します。この技術を成功させるには、細胞をできるだけ早く培地とインキュベーター環境に迅速に入れることが重要です。
まず、ヘパリン溶液を滅菌生理食塩水で1ミリリットルあたり100単位に希釈します。2つの50ミリリットルコニカルチューブと2つの60ミリリットルシリンジのそれぞれに3〜4ミリリットルのヘパリン溶液を追加します。次に、希釈せずに1ミリリットルあたり1, 000単位のヘパリン溶液を延長チューブに引き込みます。
ヘパリンで満たされた延長チューブの一方の端に19ゲージの針を接続し、延長チューブのもう一方の端にヘパリンを含む60ミリリットルのシリンジを接続します。次に、麻酔をかけたブタの大腿鼠径部をベタジンスクラブ溶液できれいにします。19ゲージの針で大腿静脈または動脈を穿刺し、毎秒1〜2ミリリットルで、50ミリリットルの血液をゆっくりと注射器に引き込みます。
針を所定の位置に残して、すぐに延長チューブをねじり、60ミリリットルのシリンジを外します。血液をヘパリンを含む50ミリリットルの円錐管にゆっくりと移します。円錐形のチューブにしっかりと蓋をし、チューブを数回静かに反転させて混合し、氷の上に置きます。
残りのヘパリン含有60ミリリットルシリンジを延長チューブに接続します。延長チューブのねじれをほどき、さらに50ミリリットルの血液をシリンジにゆっくりと吸い込みます。すぐに動脈または静脈から針を外し、残りの血液を延長チューブからシリンジにゆっくりと引き抜きます。
60ミリリットルのシリンジを延長チューブから外し、残りのヘパリンを含む50ミリリットルの円錐形のチューブに血液をゆっくりと移します。50ミリリットルの円錐形のチューブにしっかりと蓋をし、数回静かに反転させて混合し、氷の上に置きます。ブタの大腿鼠径部に圧力止血を適用します。
4本の50ミリリットルの円錐管でPBSで血液を1対1に希釈します。25ミリリットルの室温ですぐに使用できる密度勾配溶液を8本の50ミリリットルの円錐管に加えます。密度勾配溶液を含む各50ミリリットルの円錐管内に25ミリリットルの血液生理食塩水を、ピペットチップに対して鋭角に保持してゆっくりとピペットします。
チューブを560 g、室温で30分間遠心分離します。密度勾配溶液の上と透明な血漿の下の単核細胞の濁った層であるバフィーコートを細いピペットで各チューブから慎重に集め、2つの新しい50ミリリットルの円錐形チューブに均等に分配します。チューブを含む密度勾配溶液を廃棄します。
6ウェルプレートをフィブロネクチンでコーティングするには、ヒト血漿フィブロネクチンを滅菌水で1ミリリットルあたり1ミリグラムに希釈してストック溶液を作ります。600マイクロリットルのフィブロネクチンストック溶液を3ミリリットルのPBSで希釈することにより、3.6ミリリットルのフィブロネクチン作業溶液を作ります。600マイクロリットルのフィブロネクチン作業溶液を6ウェルプレートの各ウェルに移し、均一にコーティングされるまで穏やかに揺り動かします。
そして、各ウェルから溶液を静かに吸引します。フィブロネクチンがコーティングするのを待って単核細胞を洗浄するには、チューブに最大45ミリリットルのPBSを補充し、560 X gで5分間遠心分離し、ローブレークで摂氏4度で遠心分離します。両方のチューブから上清を吸引します。
各細胞ペレットを25ミリリットルのPBSに再懸濁します。各セルペレットを5ミリリットルのPBSに再懸濁し、15ミリリットルの0.8%塩化アンモニウム溶液を各チューブに加えます。PBSを加えて前と同じように細胞を洗浄します。
両方のチューブから上清を吸引します。各細胞ペレットを25ミリリットルのPBSに再懸濁します。各細胞ペレットを、10%FBSおよび1X抗生物質抗真菌溶液を添加した6ミリリットルのEGM-2培養液に再懸濁します。
2ミリリットルの細胞懸濁液をフィブロネクチンコーティングされた6ウェルプレートの各ウェルに静かに移し、均一にコーティングされるまで穏やかに揺り動かします。細胞を播種してから24時間後、1ミリリットルの新鮮な培養液を各ウェルに穏やかに加えます。翌日、各ウェルから1.5ミリリットルの培養液を穏やかに吸引し、1.5ミリリットルの新鮮な培地と交換します。
次の5日間は、ウェルあたり2ミリリットルの新鮮な培地で培養培地を静かに交換します。低出力4倍対物レンズ顕微鏡下で細胞培養を定期的に可視化します。培養開始からBOECコロニーが観察されるまで培養細胞の形態を観察した。
少数の接着細胞集団が培養皿に付着して増殖し始め、非接着細胞は培地の変更とともに除去されました。コロニーは、中心点から放射状に外側に増殖する内皮様細胞の集まりとして6日目に最初に現れました。培養が進むにつれて、細胞コロニーはより密になり、成熟内皮細胞と同様の石畳の形態を示しました。
二次元位相差顕微鏡を使用して、無血清培地および完全増殖培地でのチューブ形成を画像化しました。両方の培地条件の細胞は形態学的分化を受け、毛細管様構造の広範なネットワークに急速に組織化されました。BOECsはさらに、成熟内皮細胞マーカーCD31または血小板内皮細胞接着分子1の発現によって特徴付けられた。
BOECはCD31の均一な発現を示した。さらに、陽性対照と比較したCD14 AF 700抗体を用いたBOECのフローサイトメトリー分析により、単球マーカーCD14について陰性に染色された細胞として、PBMCの陽性対照群と比較してEPCの不在が確認された。 陽性CD14染色は青色で示し、非染色細胞は赤色で示した。
採血時には、隣接する層をできるだけ少なく収集しながら、できるだけ多くのバフィーコート層を収集することが不可欠です。この技術により、研究者は、内皮細胞が自己血液伸長するブタモデルを使用して、植込み型心血管デバイスを内皮化するための新しい戦略を研究することができました。
