Il protocollo fornisce cellule endoteliali di crescita del sangue altamente proliferative che possono essere utilizzate per varie indagini di ingegneria tissutale, terapia cellulare e modellizzazione delle malattie. Questa tecnica produce costantemente molte cellule da un singolo prelievo di sangue. Affinché questa tecnica abbia successo, è fondamentale far entrare rapidamente le cellule nel terreno di coltura e nell'ambiente dell'incubatore il prima possibile.
In primo luogo, diluire la soluzione di eparina a 100 unità per millilitro in soluzione salina sterile. Aggiungere da tre a quattro millilitri di soluzione di eparina a ciascuno dei due tubi conici da 50 millilitri e due siringhe da 60 millilitri. Quindi, aspirare 1.000 unità non diluite per soluzione di eparina da millilitro in un tubo di prolunga.
Collegare un ago da 19 gauge a un'estremità del tubo di prolunga riempito di eparina e una siringa da 60 millilitri contenente eparina all'altra estremità del tubo di prolunga. Quindi, pulire l'area inguinale del femore di un maiale anestetizzato con una soluzione di scrub Betadine. Forare la vena o l'arteria femorale con un ago calibro 19 e da uno a due millilitri al secondo, aspirare lentamente 50 millilitri di sangue nella siringa.
Lasciando l'ago in posizione, attorcigliare immediatamente il tubo di prolunga e scollegare la siringa da 60 millilitri. Trasferire lentamente il sangue in un tubo conico da 50 millilitri contenente eparina. Tappare strettamente il tubo conico, capovolgere delicatamente il tubo alcune volte per mescolare e posizionarlo sul ghiaccio.
Collegare la restante siringa da 60 millilitri contenente eparina al tubo di prolunga. Aprire il tubo di prolunga e aspirare lentamente ulteriore 50 millilitri di sangue nella siringa. Rimuovere immediatamente l'ago dall'arteria o dalla vena e aspirare lentamente il sangue rimanente dal tubo di prolunga nella siringa.
Scollegare la siringa da 60 millilitri dal tubo di prolunga e trasferire lentamente il sangue al tubo conico da 50 millilitri contenente eparina rimanente. Tappare strettamente il tubo conico da 50 millilitri, capovolgere delicatamente alcune volte per mescolare e posizionare sul ghiaccio. Applicare l'emostasi a pressione sull'area inguinale del femore del maiale.
Diluire il sangue uno a uno con PBS in quattro tubi conici da 50 millilitri. Aggiungere 25 millilitri di temperatura ambiente, soluzione di gradiente di densità pronta all'uso a otto tubi conici da 50 millilitri. Pipettare lentamente 25 millilitri di soluzione salina di sangue all'interno di ciascun tubo conico da 50 millilitri contenente una soluzione a gradiente di densità tenendo il tubo ad angolo acuto rispetto alla punta della pipetta.
Centrifugare i tubi per 30 minuti a 560 g e temperatura ambiente. Raccogliere con cura il buffy coat, che è lo strato torbido di celle mononucleate sopra la soluzione del gradiente di densità e sotto il plasma trasparente, da ciascun tubo con una pipetta sottile e distribuirlo uniformemente in due nuovi tubi conici da 50 millilitri. Eliminare la soluzione di gradiente di densità contenente tubi.
Per rivestire una piastra a sei pozzetti con fibronectina, fare una soluzione madre di fibronectina plasmatica umana diluendola a un milligrammo per millilitro in acqua sterile. Produrre 3,6 millilitri di una soluzione di lavoro di fibronectina diluendo 600 microlitri di soluzione madre di fibronectina in tre millilitri di PBS. Trasferire 600 microlitri della soluzione di lavoro di fibronectina in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti e oscillare delicatamente fino a quando non sono uniformemente rivestiti.
E aspirare delicatamente la soluzione da ogni pozzetto. Per lavare le cellule mononucleate in attesa che la fibronectina si rivesta, rabboccare i tubi con un massimo di 45 millilitri di PBS, centrifugare per cinque minuti a 560 X g e quattro gradi Celsius con bassa rottura. Aspirare il surnatante da entrambi i tubi.
Risospendere ogni pellet cellulare in 25 millilitri di PBS. Risospendere ogni pellet cellulare in cinque millilitri di PBS e aggiungere 15 millilitri di soluzione di cloruro di ammonio allo 0,8% a ciascun tubo. Lavare le celle come prima aggiungendo PBS.
Aspirare il surnatante da entrambi i tubi. Risospendere ogni pellet cellulare in 25 millilitri di PBS. Risospendere ogni pellet cellulare in sei millilitri di terreno di coltura EGM-2 integrato con 10% FBS e soluzione antibiotico-antimicotica 1X.
Trasferire delicatamente due millilitri della sospensione cellulare a ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti rivestita di fibronectina e dondolare delicatamente fino a quando non è uniformemente rivestito. 24 ore dopo aver seminato le cellule, aggiungere delicatamente un millilitro di terreno di coltura fresco a ciascun pozzetto. Il giorno seguente, aspirare delicatamente 1,5 millilitri di terreno di coltura da ciascun pozzetto e sostituirlo con 1,5 millilitri di terreno di coltura fresco.
Per i prossimi cinque giorni, cambiare delicatamente il terreno di coltura con due millilitri di terreno di coltura fresco per pozzetto. Visualizza regolarmente le colture cellulari al microscopio ottico obiettivo 4X a bassa potenza. La morfologia delle cellule in coltura è stata osservata dall'inizio della coltura fino a quando sono state osservate le colonie di BOEC.
Una popolazione più piccola di cellule aderenti ha iniziato ad attaccarsi ai piatti di coltura e crescere, mentre le cellule non aderenti sono state rimosse con cambiamenti del terreno di coltura. Le colonie sono apparse per la prima volta il sesto giorno come una raccolta di cellule simili all'endotelio che proliferano radialmente verso l'esterno da un punto centrale. Man mano che la coltura progrediva, le colonie cellulari diventavano più dense e mostravano una morfologia di ciottoli simile alle cellule endoteliali mature.
La microscopia a contrasto di fase bidimensionale è stata utilizzata per visualizzare la formazione di tubi in un mezzo privo di siero e in un terreno di crescita completo. Le cellule in entrambe le condizioni dei mezzi hanno subito una differenziazione morfologica e rapidamente organizzate in estese reti di strutture capillari simili a tubi. Le BOEC sono state ulteriormente caratterizzate dall'espressione del marcatore di cellule endoteliali mature CD31 o della molecola di adesione delle cellule endoteliali piastriniche.
I BOEC hanno mostrato un'espressione uniforme di CD31. Inoltre, l'analisi citometrica a flusso di BOEC con anticorpo CD14 AF 700 rispetto al controllo positivo ha confermato l'assenza di EPC, poiché la cellula è risultata negativa per il marcatore monocitario CD14 rispetto al gruppo di controllo positivo delle PBMC. Colorazione CD14 positiva mostrata in blu e cellule non colorate mostrate in rosso.
Durante la raccolta del sangue, è essenziale raccogliere il più possibile lo strato di mantello buffy raccogliendo il meno possibile degli strati adiacenti. Questa tecnica ha permesso ai ricercatori di studiare nuove strategie per l'endotelializzazione di dispositivi cardiovascolari impiantabili utilizzando un modello di maiale con cellule endoteliali autologhe di esaltazione del sangue.
