يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علاج microRNA إلى الكلى ، والتي لا تزال تمثل تحديا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها مكنت العلاج بمحاكاة microRNA للكلى دون التسبب في استجابة للإنترفيرون أو عدم الاستقرار الجيني. ابدأ بإذابة 10 ميكرولترات من PEI-NPs في 90 ميكرولتر من محلول الجلوكوز 5٪ في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.
ثم دوامة الأنبوب بلطف وتدور لأسفل. امزج 50 ميكرولترا من miRNAs المركبة صناعيا المذابة في 100 ميكرومولار من الماء الخالي من النيوكلياز مع 50 ميكرومولار من محلول الجلوكوز 10٪ في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 ملليلتر. دوامة الأنبوب بلطف وتدور لأسفل.
تنتج هذه العملية miRNA المذاب في محلول الجلوكوز 5٪. ثم امزج 100 ميكرولتر من PEI-NPs في محلول جلوكوز 5٪ و 100 ميكرولتر من miRNA يحاكي في محلول جلوكوز 5٪. دوامة الأنبوب بلطف وتدور لأسفل.
احتضان الخليط لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإعداد مركب مستقر من تقليد PEI-NPs miRNA. قم بإذابة ميكرولتر من PEI-NPs في 98 ميكرولتر من محلول الجلوكوز 10٪ في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 ملليلتر. دوامة الأنبوب بلطف وتدور لأسفل.
ثم أضف 100 ميكرولتر من تقليد miRNA المسمى Cy3 إلى 100 ميكرولتر من PEI-NPs في محلول جلوكوز 10٪ ودوامة الأنبوب برفق. احتضان الخليط لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإعداد مركب مستقر من PEI-NPs-Cy3-المسمى miRNA-محاكاة. ضع فأر UUO أولا في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر بدون تخدير ثم ضع الذيل من خلال فتحة معدة في الغطاء.
املأ حقنة سعة ملليلتر واحد بإبرة قياس 30 مع 200 ميكرولتر من مركب تقليد PEI-NPs-Cy3-المسمى miRNA وحقن المركب عبر الوريد الخلفي للفأر. بعد ذلك ، قم بعمل شق في الجلد والعضلات والأضلاع بالمقص الجراحي والملقط لكشف القلب. بعد إجراء شق في الأذين الأيمن ، قم بحقن PBS في البطين الأيسر حتى يتغير لون الكلى إلى اللون الأصفر الباهت.
يشير هذا إلى أن جسم الماوس بالكامل مملوء ب PBS. بعد جمع الكلى ، قم بإزالة الكبسولات الكلوية ، واغسلها مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني. تضمين عينات أنسجة الكلى في مركب OCT وتجميدها في النيتروجين السائل.
استخدم جهاز التبريد لتحضير الأقسام وتركيب الأقسام على شرائح زجاجية مطلية بالسيلان. قم بإصلاحها باستخدام 4٪ بارافورمالدهيد واغسل الشرائح برفق مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني. أخيرا ، تصور تلطيخ التألق بواسطة المجهر الفلوري عند تكبير 100x و 400x وبرامج التصوير المناسبة.
توضح الصورة التمثيلية بنية مركب محاكاة PEI-NPs-miRNA. يتم تصوير توصيل وتأثيرات miRNA-146a-5p-mimic باستخدام PEI-NPs في التليف الكلوي في هذه الصور. أظهر التحليل المجهري الفلوري أن حقن الوريد الذيل ل PEI-NPs يمكن أن ينقل محاكاة miRNA إلى الفضاء الخلالي الأنبوبي.
في فئران التليف الكلوي التي تنتجها UUO ، شمل ذلك الخلايا الأنبوبية الكلوية التي ليس لها شكل منتظم في الكلى والكبيبة. أظهر تحليل qRT-PCR أن حقن PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic تسبب في فرط تعبير كبير عن miRNA-146a-5p في الكلى. يظهر التحليل النسيجي مع تلطيخ سيريوس الأحمر هنا.
أظهر التحليل المجهري الفلوري أن حقن الوريد الذيل ل PEI-NPs يمكن أن ينقل miRNA محاكيا إلى الكبيبة والفضاء الخلالي الأنبوبي في كلى الفئران النموذجية الكلوية المصابة بالسكري في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر تحليل qRT-PCR أن حقن PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic تسبب في إفراط كبير في التعبير عن miRNA-181b-5p في الكلى. أظهر التحليل النسيجي مع تلطيخ حمض شيف الدوري أن حقن PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic مرة واحدة في الأسبوع من 10 إلى 20 أسبوعا من العمر يمنع تطور مرض الكلى السكري في الفئران.
يتم عرض تسليم وتأثيرات PEI-NPs-miRNA-5100-mimic في الفئران النموذجية لإصابة الكلى الحادة الناتجة عن إصابة نقص التروية هنا. تم تصوير بيانات تحليل الفحص المجهري الفلوري qRT-PCR لتقييم تأثيرات التعبير المفرط ل miRNA-5100 بعد حقن PEI-NPs-miRNA-5100-mimic والتحليل النسيجي للكلى الملطخة بالهيماتوكسيلين-يوسين في هذه الصور. PEI-NPs التي يتم حقنها عبر الوريد الذيل قبل يومين من إجراء إصابة نقص التروية ، أو IRI ، تمنع تطور إصابة الكلى الحادة التي يسببها IRI.
عند إجراء هذه التقنية ، قم بإعداد أقسام بسمك خمسة ميكرومتر والتي تشمل أكبر قدر ممكن من أنسجة الكلى. يمكنك أيضا تحضير أقسام بسمك سبعة ميكرومتر.
