اعتمدت الأساليب السابقة على طرق شديدة التوغل للحصول على الخلايا الجذعية الوسيطة في المختبر ، ولكن تلك الخلايا الجذعية الوسيطة كان لها قيود على إنتاج مجموعة غير متجانسة من 30٪ بكفاءة تتراوح من 30 إلى 60٪ هنا ، نقدم بروتوكولا لإنتاج عدد كبير من الخلايا الجذعية الوسيطة سريعة التكاثر والتي يمكن أن تنتج مجموعة نقية من الخلايا الشحمية الناضجة عن طريق الفرز باستخدام أحمر النيل. عندما تصل iPSCs إلى التقاء 80٪ ، اغسل الخلايا باستخدام DPBS وأضف وسط تفكك يحتوي على EDTA. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.
بعد دقيقة واحدة ، قم بشفط كاشف التفكك وضع الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة إضافية. بعد ذلك ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة. أضف ملليلتر واحد من وسائط StemFlex لكل بئر واجمع الخلايا بعناية في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر.
أجهزة الطرد المركزي الخلايا. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليقها برفق في ثلاثة ملليلتر من وسائط تمايز MSC التي تحتوي على 10 ميكرومول من مثبط الصخور. امزج تعليق الخلية ووزع 500 ميكرولتر لكل بئر في لوحة تثبيت منخفضة للغاية تبلغ 24 بئرا.
ثم ضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية. بعد 24 ساعة ، لحث الأجسام الجنينية التي تم الحصول عليها ، قم بجمعها في أنبوب سعة 15 ملليلتر واتركها تستقر. بعد 15 دقيقة ، قم بإزالة المادة الطافية وإضافة وسيط تمايز MSC المكمل بحمض الريتينويك 10 ميكرومولار.
أعد تعليق الأجسام الجنينية برفق وقم بتوزيع 500 ميكرولتر لكل بئر في نفس لوحة التثبيت المنخفضة للغاية المكونة من 24 بئرا. ثم ضع اللوحة في الحاضنة. بعد 48 ساعة ، اجمع الأجسام الجنينية في أنبوب سعة 15 ملليلتر واتركها تستقر لمدة 15 دقيقة.
ثم قم بإزالة المادة الطافية وإضافة وسيط تمايز MSC المكمل بحمض الريتينويك 0.1 ميكرومولار. بعد تعليق الأجسام الجنينية ، قم بتوزيع 500 ميكرولتر لكل بئر في نفس اللوحة المكونة من 24 بئرا وضع اللوحة في الحاضنة. بعد ثمان وأربعين ساعة من آخر علاج بحمض الريتينويك ، اجمع الأجسام الجنينية ، وأزل المادة الطافية ، وأضف وسط DMEM منخفض الجلوكوز بدون السيتوكينات.
أعد تعليق وتوزيع 500 ميكرولتر من تعليق الخلية برفق لكل بئر في نفس لوحة التثبيت المنخفضة للغاية المكونة من 24 بئرا ، ثم احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية. بعد 48 ساعة ، لطلاء الأجسام الجنينية المشتقة من iPSC ، اجمع الأجسام الجنينية في أنبوب سعة 15 ملليلتر ، واسمح لها بالاستقرار ، ثم قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليقها في ملليلتر من وسط تمايز MSC الجديد. بعد ذلك ، قم بنقل التعليق إلى بئرين من صفيحة ستة آبار مغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية.
بعد خمسة أيام ، استبدل الوسائط المستهلكة بوسط تمايز MSC جديد يحتوي على 2.5 نانوجرام لكل ملليلتر من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي واستمر في تمايز MCS لمدة تصل إلى 11 و 15 يوما. عندما تصل الأجسام الجنينية المطلية إلى التقاء 80 إلى 90٪ ، قم بتمريرها عن طريق الغسيل باستخدام DPBS ، وإضافة Trypsin-EDTA ، وتحضينها عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. أخرج التربسين-EDTA من الطبق واحتضانه مرة أخرى عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.
بعد ذلك ، أضف وسائط ملليلتر واحدة لكل بئر. بعد ثلاث دقائق ، اجمع الخلايا باستخدام وسائط تمايز MSC في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر وطرد مركزي للخلايا. ثم أعد تعليق الخلايا في وسط تمايز MSC يحتوي على عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي وقم بطلاء الخلايا على ألواح مغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي بنسبة واحد إلى ثلاثة.
بعد أن تصل MSCs إلى التقاء 90٪ ، استمر في زراعتها لمدة 48 ساعة أخرى للسماح لها بالخضوع لفترة من توقف النمو. ثم قم بإزالة الوسيط وغسل الخلايا باستخدام DBPS. بعد الغسيل ، أضف وسط تمايز الخلايا الشحمية الكامل إلى اللوحة واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية.
قم بتغيير الوسيط كل يوم لمدة 14 يوما. التفريق بين MSCs المشتقة من iPSC إلى خلايا دهنية. لفرز الخلايا الشحمية باستخدام أحمر النيل ، قم بإعداد محلول عمل أحمر النيل في DMSO كما هو موضح في مخطوطة النص.
قبل الاستخدام ، قم بإذابة محلول المخزون وإعادة تكوينه في DPBS للوصول إلى تركيز محلول عمل 300 نانومولار. في أو بعد اليوم 14 من تمايز الخلايا الشحمية ، تخلص من الوسط من الخلايا واغسله باستخدام DPBS. ثم أضف حل العمل الأحمر النيل.
غطي اللوحة واحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية. بعد 15 دقيقة ، استبدل محلول النيل الأحمر ب Trypsin-EDTA واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة أربع دقائق. ثم اجمع الخلايا باستخدام DMEM التي تحتوي على 5٪ FBS في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي للخلايا.
قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في DPBS بكثافة 1 مليون خلية لكل ملليلتر. ثم باستخدام فارز FACS ، اعزل الخلايا الموجبة لأحمر النيل باستخدام قناة FL-1. اجمع الخلايا التي تم فرزها وأعد زراعتها في وسائط تمايز الخلايا الشحمية أو انتقل إلى استخراج الحمض النووي الريبي متبوعا بالتحليل الكمي لعلامات تمايز الخلايا الشحمية.
عند بدء التمايز ، تكون الخلايا المطلية بالتعليق مستديرة ذات حدود خلية محددة وقطرها صغير إلى متوسط الحجم. ويلاحظ بقاء الأجسام الجنينية من خلال سلوك الانتشار السريع الذي يؤدي إلى ظهور المزيد من MSCs. يتم الاحتفاظ بسلوك الانتشار السريع هذا ، جنبا إلى جنب مع مورفولوجيتها الغريبة والممدودة ، حتى بعد تمرير MSCs على ألواح جديدة مغلفة بالمصفوفة.
ينتج عن التمايز الجيد MSCs موثوقة بكفاءة تعبير تزيد عن 90٪ لعلامات سطح اللحمة المتوسطة CD73 و CD44 و CD90. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر تقييم الخلايا لعدم وجود علامات سطحية تصور النمط الظاهري المكونة للدم CD14 و CD34 و CD19 كفاءة تعبير أقل من 1٪ ، ويشير التعبير العالي في التوزيع السيتوبلازمي ل FABP4 ، وهو علامة للخلايا الشحمية المتمايزة نهائيا ، إلى نضجها التنموي. بالإضافة إلى ذلك ، يشير التعبير العالي عن الأديبونيكتين ، وهو علامة أخرى لنضج الخلايا الشحمية ، إلى أن الخلايا الشحمية وظيفية بما يكفي للخضوع لتخزين الدهون وتكوين الدهون استجابة لإشارات الجلوكوز.
عند التلوين ، يرتبط أحمر النيل حصريا بالخلايا الشحمية الناضجة الحاملة للدهون ، مما يجعله أداة فعالة لفرز الخلايا الشحمية الناضجة باستخدام قياس التدفق الخلوي المنشط بالفلورسنت. تظهر الخلايا الموجبة لأحمر النيل تنظيما كبيرا لعلامات النضج بمقدار ضعفين على الأقل مقارنة بالخلايا غير المصنفة. يجب أن تكون لطيفا جدا أثناء جمع الخلايا أثناء تكوين الجسم الجنيني وتفكك الخلايا الوسيطة لأن ذلك سيؤثر بشكل كبير على كفاءة البقاء على قيد الحياة بعد تفكك الخلايا الجذعية الوسيطة.
يمكن إخضاع السكان النقيين للخلايا الشحمية التي تم الحصول عليها من المرضى الحاملين للطفرات لتسلسل وظيفي وكامل للنسخ لتحديد المسارات التنظيمية والإشارات المتأثرة بطفرة معينة دون أن تتأثر البيانات بعدم تجانس العينة. ستسمح هذه التقنية بتوليد خلايا جذعية وسيطة قابلة للتطوير في المختبر ، مما يلغي الحاجة إلى حصادها من المتبرعين البشريين لتمييزها بسهولة إلى الخلايا الشحمية والخلايا الغضروفية والخلايا العظمية لفهم التسبب في الأمراض المرتبطة بالأنسجة.
