종래의 접근법은 시험관 내에서 중간엽 줄기세포를 얻기 위해 매우 침습적인 방법에 의존하였으나, 이러한 중간엽 줄기세포는 30%에서 60% 범위의 효율로 30%의 이질적인 풀을 생산하는 데 한계가 있었다. iPSC가 80% 합류에 도달하면 DPBS로 세포를 세척하고 EDTA가 포함된 해리 배지를 추가합니다. 섭씨 37도에서 1분 동안 세포를 배양합니다.
1분 후, 해리 시약을 흡인하고 세포를 섭씨 37도에서 추가로 1분 동안 놓습니다. 그런 다음 인큐베이터에서 플레이트를 꺼냅니다. 웰당 1밀리리터의 StemFlex 배지를 추가하고 15밀리리터의 원뿔형 튜브에 세포를 조심스럽게 수집합니다.
세포를 원심 분리하십시오. 상청액을 제거하고, 10 마이크로몰의 암석 억제제를 함유하는 3밀리리터의 MSC 분화 배지에 이들을 부드럽게 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 혼합하고 웰 당 500 마이크로리터를 24-웰 초저 부착 플레이트에 분배한다.
그런 다음 섭씨 37도의 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 24 시간 후, 획득 된 배아체를 유도하기 위해 15 밀리리터 튜브에 모아 정착시킵니다. 15분 후, 상청액을 제거하고, 10 마이크로몰 레티노산으로 보충된 MSC 분화 배지를 첨가한다.
배아체를 부드럽게 재현탁하고 동일한 24웰 초저 부착 플레이트에 웰당 500마이크로리터를 분배합니다. 그런 다음 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 48 시간 후, 배아체를 15 밀리리터 튜브에 모으고 15 분 동안 안정되도록합니다.
그런 다음 상청액을 제거하고 0.1 마이크로몰 레티노산이 보충된 MSC 분화 배지를 추가합니다. 배아체를 재현탁 한 후, 동일한 24 웰 플레이트에 웰 당 500 마이크로 리터를 분배하고 플레이트를 인큐베이터에 넣는다. 마지막 레티노산 처리 48시간 후, 배아체를 채취하고, 상층액을 제거하고, 사이토카인이 없는 DMEM 저혈당 배지를 첨가한다.
동일한 24-웰 초저부착 플레이트에 웰당 500마이크로리터의 세포 현탁액을 부드럽게 재현탁하고 분배한 다음, 플레이트를 섭씨 37도에서 배양합니다. 48시간 후, iPSC 유래 배아체를 플레이팅하고, 배아체를 15밀리리터 튜브에 수집하고, 이들이 침전되도록 한 다음, 상청액을 제거하고, 2밀리리터의 신선한 MSC 분화 배지에 재현탁시킨다. 다음으로, 현탁액을 기저막 매트릭스 코팅된 6웰 플레이트의 2웰로 옮기고 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.
5일 후, 사용한 배지를 염기성 섬유아세포 성장 인자 밀리리터당 2.5나노그램을 함유한 새로운 MSC 분화 배지로 교체하고 최대 11일 및 15일 동안 MCS 분화를 계속합니다. 도금된 배아체가 80-90% 합류에 도달하면 DPBS로 세척하고 트립신-EDTA를 첨가하고 섭씨 37도에서 1분 동안 배양하여 계대합니다. 플레이트에서 트립신-EDTA를 제거하고 섭씨 37도에서 1분 동안 다시 배양합니다.
다음으로, 웰 당 1 밀리리터 매체를 첨가하십시오. 3분 후, MSC 분화 배지를 사용하여 세포를 15 밀리리터 원뿔형 튜브에 모으고, 세포를 원심분리한다. 그런 다음 염기성 섬유아세포 성장 인자를 함유하는 MSC 분화 배지에 세포를 재현탁하고 세포를 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 1 대 3의 비율로 플레이트합니다.
중간엽 줄기세포가 90% 합류에 도달한 후 48시간 동안 계속 배양하여 성장 정지 기간을 거치도록 합니다. 그런 다음 배지를 제거하고 DBPS로 세포를 세척합니다. 세척 후, 완전한 지방 세포 분화 배지를 플레이트에 첨가하고 섭씨 37도에서 세포를 배양한다.
14 일 동안 격일로 매체를 변경하십시오. iPSC 유래 중간엽 줄기세포를 지방세포로 분화합니다. 나일 레드를 사용하여 지방 세포를 분류하려면 텍스트 원고에 설명 된대로 DMSO에서 나일 레드 작업 용액을 준비하십시오.
사용하기 전에 원액을 해동하고 DPBS에서 재구성하여 300나노몰 작동 용액 농도를 얻습니다. 지방세포 분화 14일째 또는 그 후, 세포로부터 배지를 버리고 DPBS를 사용하여 세척한다. 그런 다음 나일 레드 작업 용액을 추가하십시오.
플레이트를 덮고 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 15분 후 나일레드 용액을 트립신-EDTA로 교체하고 섭씨 37도에서 4분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 15밀리리터 원뿔형 튜브에 5%FBS가 포함된 DMEM을 사용하여 세포를 수집하고 세포를 원심분리합니다.
상청액을 제거하고 DPBS에서 밀리리터당 100만 개의 세포 밀도로 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 FACS 분류기를 사용하여 FL-1 채널을 사용하여 나일 적색 양성 세포를 분리합니다. 분류된 세포를 수집하여 지방세포 분화 배지에서 재배양하거나 RNA 추출을 진행한 후 지방세포 분화 마커의 정량 분석을 진행합니다.
분화가 시작될 때, 현탁액에 도금 된 세포는 정의 된 세포 경계로 둥글고 직경이 작거나 중간 크기입니다. 배아체의 생존력은 더 많은 중간엽을 발생시키는 빠른 증식 거동에 의해 관찰됩니다. 이러한 빠른 증식 거동은 특이하고 길쭉한 형태와 함께 중간엽 줄기세포를 새로운 매트릭스 코팅 플레이트에 통과시킨 후에도 유지됩니다.
우수한 분화는 중간엽 표면 마커 CD73, CD44 및 CD90의 발현 효율이 90% 이상인 신뢰할 수 있는 중간엽 줄기세포를 생성합니다. 또한, 조혈 표현형 CD14, CD34 및 CD19를 묘사하는 표면 마커의 부재에 대한 세포 평가는 1% 미만의 발현 효율을 보였으며, 말기 분화 지방세포의 마커인 FABP4의 세포질 분포에서 높은 발현은 이들의 발달 성숙도를 나타낸다. 또한, 지방세포 성숙의 또 다른 지표인 아디포넥틴의 높은 발현은 지방세포가 포도당 신호전달에 반응하여 지질 저장 및 지방생성을 겪을 만큼 충분히 기능적임을 나타냅니다.
염색 시 나일 레드는 지질을 함유한 성숙한 지방세포에만 독점적으로 결합하여 형광 활성화 유세포 분석을 사용하여 성숙한 지방세포를 분류하는 데 효과적인 도구가 됩니다. 나일 적색 양성 세포는 분류되지 않은 세포에 비해 성숙 마커의 상당한 상향 조절을 보여줍니다. 배아체 형성 및 중간엽 세포 해리 동안 세포를 수집하는 동안 매우 부드러워야 하며, 이는 중간엽 줄기 세포의 해리 후 생존 효율에 큰 영향을 미치기 때문입니다.
돌연변이를 가지고 있는 환자로부터 얻은 순수한 지방세포 집단은 샘플 이질성에 의해 영향을 받는 데이터 없이 특정 돌연변이에 의해 영향을 받는 조절 및 신호 전달 경로를 결정하기 위해 기능적 및 전체 전사체 시퀀싱을 받을 수 있습니다. 이 기술은 시험관 내에서 중간엽 줄기 세포의 확장 가능한 생성을 가능하게 하여 조직 관련 질병 발병 기전을 이해하기 위해 지방 세포, 연골 세포 및 골 세포로 쉽게 분화하기 위해 인간 기증자로부터 수확할 필요가 없습니다.
