גישות קודמות הסתמכו על שיטות פולשניות ביותר להשגת תאי גזע מזנכימליים במבחנה, אך לתאי גזע מזנכימליים אלה הייתה מגבלה של ייצור מאגר הטרוגני של 30% עם יעילות הנעה בין 30% ל -60%כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור מספר גבוה של תאי גזע מזנכימליים המתרבים במהירות שיכולים לייצר אוכלוסייה טהורה של אדיפוציטים בוגרים על ידי מיון באמצעות אדום הנילוס. כאשר תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים הגיעו למפגש של 80%, שטפו את התאים עם DPBS והוסיפו אמצעי דיסוציאציה המכיל EDTA. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך דקה אחת.
לאחר דקה אחת, שואפים מגיב הדיסוציאציה ומניחים את התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך דקה נוספת. לאחר מכן, להסיר את הצלחת מן האינקובטור. הוסף מיליליטר אחד של מדיה StemFlex לכל באר בזהירות לאסוף את התאים בצינור חרוטי 15 מיליליטר.
צנטריפוגה של התאים. הסר את supernatant, ובעדינות resuspend אותם בשלושה מיליליטר של מדיה התמיינות MSC המכיל 10 מיקרומול של מעכב סלעים. מערבבים את תרחיף התא ומפיצים 500 מיקרוליטר לבאר בצלחת חיבור נמוכה במיוחד של 24 בארות.
לאחר מכן מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, כדי לגרום לגוף העוברי שהושג, אספו אותם בצינור של 15 מיליליטר ואפשרו להם להתיישב. לאחר 15 דקות, להסיר את supernatant ולהוסיף מדיום התמיינות MSC בתוספת 10 חומצה רטינואית מיקרומולרית.
להשהות מחדש את הגוף העוברי בעדינות ולהפיץ 500 מיקרוליטר לכל באר באותה צלחת חיבור 24 באר נמוכה במיוחד. לאחר מכן מניחים את הצלחת באינקובטור. לאחר 48 שעות, לאסוף את הגופות העובריות בצינור 15 מיליליטר ולאפשר להם להתיישב במשך 15 דקות.
לאחר מכן להסיר את supernatant ולהוסיף מדיום התמיינות MSC בתוספת 0.1 חומצה רטינואית micromolar. לאחר השעיית הגופים העובריים, מפיצים 500 מיקרוליטר לבאר באותה צלחת בת 24 בארות ומניחים את הצלחת באינקובטור. ארבעים ושמונה שעות לאחר הטיפול האחרון בחומצה רטינואית, אספו את הגוף העוברי, הסירו את הסופרנטנט והוסיפו מדיום DMEM דל גלוקוז ללא ציטוקינים.
השהה מחדש בעדינות והפץ 500 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר באותה צלחת חיבור נמוכה במיוחד של 24 בארות, ולאחר מכן לדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר 48 שעות, כדי לצלוח את הגופים העובריים שמקורם ב- iPSC, לאסוף את הגופים העובריים בצינור של 15 מיליליטר, לאפשר להם לשקוע, ואז להסיר את supernatant, ולהשהות מחדש בשני מיליליטר של מדיום התמיינות MSC טרי. לאחר מכן, להעביר את המתלה לשתי בארות של צלחת ממברנה מרתף מצופה מטריצה שש בארות לדגור את התאים ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר חמישה ימים, החלף את המדיה המשומשת במדיום התמיינות MSC טרי המכיל 2.5 ננוגרם למיליליטר של גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי והמשך את התמיינות MCS למשך עד 11 ו -15 ימים. כאשר הגופים העובריים המצופים הגיעו למפגש של 80% עד 90%, עברו אותם על ידי שטיפה עם DPBS, הוספת טריפסין-EDTA, ודגירת טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. מוציאים את הטריפסין-EDTA מהצלחת ודגרים שוב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה.
לאחר מכן, להוסיף מדיה מיליליטר אחד לכל באר. לאחר שלוש דקות, לאסוף את התאים באמצעות מדיה התמיינות MSC בצינור חרוטי 15 מיליליטר צנטריפוגה את התאים. לאחר מכן יש להשהות מחדש את התאים במדיום התמיינות MSC המכיל גורם גדילה פיברובלסטי בסיסי ולצלחת את התאים על לוחות מצופים מטריצה של קרום מרתף ביחס של אחד עד שלושה.
לאחר שה-MSCs הגיעו למפגש של 90%, המשיכו לגדל אותם במשך 48 שעות נוספות כדי לאפשר להם לעבור תקופה של עצירת גדילה. לאחר מכן להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם DBPS. לאחר השטיפה, מוסיפים אמצעי התמיינות אדיפוציט מלא לצלחת ודגרים על התאים ב 37 מעלות צלזיוס.
שנה את המדיום כל יומיים במשך 14 יום. הבדיל MSCs שמקורם ב-iPSC לאדיפוציטים. כדי למיין את האדיפוציטים באמצעות אדום הנילוס, הכן את פתרון העבודה האדום של הנילוס ב- DMSO כמתואר בכתב היד של הטקסט.
לפני השימוש, הפשיר את תמיסת המלאי ובנה אותה מחדש ב- DPBS כדי להשיג ריכוז תמיסת עבודה של 300 ננו-מולרית. ביום ה-14 של התמיינות האדיפוציט או אחריו, יש להשליך את המדיום מהתאים ולשטוף באמצעות DPBS. לאחר מכן הוסף פתרון עבודה אדום נילוס.
מכסים את הצלחת ודגרים על התאים ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר 15 דקות, החליפו את התמיסה האדומה של הנילוס בטריפסין-EDTA ודגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע דקות. לאחר מכן לאסוף את התאים באמצעות DMEM המכיל 5% FBS בצינור חרוטי 15 מיליליטר צנטריפוגה את התאים.
הסר את הסופרנאטנט והשהה מחדש את התאים ב- DPBS בצפיפות של 1 מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן באמצעות מיון FACS, בודד את התאים האדומים האדומים של הנילוס באמצעות ערוץ FL-1. לאסוף את התאים הממוינים ולגדל אותם מחדש במדיה התמיינות אדיפוציטים או להמשיך מיצוי RNA ואחריו ניתוח כמותי של סמני התמיינות אדיפוציטים.
עם תחילת ההתמיינות, התאים המצופים בתרחיף הם עגולים עם גבולות תא מוגדרים וקוטרם קטן עד בינוני. הכדאיות של גופים עובריים נצפתה על ידי התנהגות ההתרבות המהירה המולידה יותר MSCs. התנהגות התפשטות מהירה זו, יחד עם המורפולוגיה המוזרה והמוארכת שלהם, נשמרת גם לאחר העברת MSCs על לוחות מצופים מטריצה טריים.
בידול טוב מייצר MSCs אמינים עם יעילות ביטוי גבוהה מ- 90% של סמני משטח מזנכימליים CD73, CD44 ו- CD90. בנוסף, הערכה של תאים להיעדר סמנים על פני השטח המתארים את הפנוטיפ ההמטופויטי CD14, CD34 ו- CD19 הראתה יעילות ביטוי של פחות מ -1%, ביטוי גבוה בפיזור ציטופלזמי של FABP4, סמן לאדיפוציטים ממוינים סופניים, מצביע על בשלותם ההתפתחותית. בנוסף, ביטוי גבוה של אדיפונקטין, סמן נוסף לבשלות אדיפוציטים, מצביע על כך שהאדיפוציטים פונקציונליים מספיק כדי לעבור אחסון שומנים ואדיפוגנזה בתגובה לאיתות גלוקוז.
עם הצביעה, אדום הנילוס נקשר באופן בלעדי לאדיפוציטים הבוגרים נושאי השומנים, מה שהופך אותו לכלי יעיל למיון אדיפוציטים בוגרים באמצעות ציטומטריית זרימה המופעלת על ידי פלואורסצנטי. התאים האדומים-חיוביים של הנילוס מראים עלייה משמעותית של סמני ההבשלה לפחות פי שניים בהשוואה לתאים לא ממוינים. אתה צריך להיות עדין מאוד בעת איסוף תאים במהלך היווצרות גוף עוברי ודיסוציאציה של תאים מזנכימליים מכיוון שזה ישפיע מאוד על יעילות ההישרדות לאחר דיסוציאציה של תאי גזע מזנכימליים.
אוכלוסייה טהורה של אדיפוציטים המתקבלים מחולים נושאי מוטציות יכולה להיות נתונה לריצוף תפקודי ושלם של התעתיק כדי לקבוע מסלולי ויסות ואיתות המושפעים ממוטציה מסוימת מבלי שהנתונים יושפעו מהטרוגניות המדגם. טכניקה זו תאפשר ייצור מדרגי של תאי גזע מזנכימליים במבחנה, ותבטל את הצורך בקצירתם מתורמים אנושיים כדי להבדיל אותם בקלות לאדיפוציטים, כונדרוציטים ואוסטיאוציטים להבנת פתוגנזה של מחלות הקשורות לרקמות.
