Предыдущие подходы основывались на высокоинвазивных методах получения мезенхимальных стволовых клеток in vitro, но эти мезенхимальные стволовые клетки имели ограничение на получение гетерогенного пула 30% с эффективностью от 30 до 60%Здесь мы представляем протокол для получения большого количества быстро размножающихся мезенхимальных стволовых клеток, которые могут продуцировать чистую популяцию зрелых адипоцитов путем сортировки с использованием нильского красного. Когда ИПСК достигнут 80%-ного слияния, промойте клетки DPBS и добавьте диссоциативную среду, содержащую ЭДТА. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение одной минуты.
Через одну минуту аспирируйте диссоциативный реагент и поместите клетки при температуре 37 градусов Цельсия еще на одну минуту. Далее вынимаем тарелку из инкубатора. Добавьте один миллилитр среды StemFlex в каждую лунку и тщательно соберите клетки в 15-миллилитровую коническую пробирку.
Центрифугируйте клетки. Удалите надосадочную жидкость и осторожно ресуспендируйте их в трех миллилитрах дифференцировочной среды MSC, содержащей 10 микромолей ингибитора горных пород. Смешайте суспензию ячеек и распределите 500 микролитров на лунку в 24-луночной пластине со сверхнизким креплением.
Затем поместите тарелку в инкубатор при температуре 37 градусов по Цельсию. Через 24 часа, чтобы индуцировать полученные эмбриональные тела, соберите их в 15-миллилитровую пробирку и дайте им успокоиться. Через 15 минут удалить надосадочную жидкость и добавить среду для дифференцировки МСК с добавлением 10 микромолярной ретиноевой кислоты.
Осторожно ресуспендируйте эмбриональные тела и распределите 500 микролитров на лунку в той же 24-луночной пластине со сверхнизким креплением. Затем поместите тарелку в инкубатор. Через 48 часов соберите эмбриональные тела в 15-миллилитровую пробирку и дайте им осесть в течение 15 минут.
Затем удалите надосадочную жидкость и добавьте среду для дифференцировки МСК с добавлением 0,1 микромолярной ретиноевой кислоты. После ресуспендирования эмбриональных тел распределите 500 микролитров на лунку в той же 24-луночной пластине и поместите пластину в инкубатор. Через сорок восемь часов после последней обработки ретиноевой кислотой соберите эмбриональные тела, удалите надосадочную жидкость и добавьте среду DMEM с низким содержанием глюкозы без цитокинов.
Осторожно ресуспендируйте и распределите 500 микролитров клеточной суспензии на лунку в той же 24-луночной пластине со сверхнизким креплением, затем инкубируйте пластину при 37 градусах Цельсия. Через 48 часов, чтобы пластинировать эмбриональные тела, полученные из ИПСК, соберите эмбриональные тела в 15-миллилитровую пробирку, дайте им осесть, затем удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте в двух миллилитрах свежей среды для дифференцировки МСК. Затем перенесите суспензию в две лунки шестилуночной пластины с матричным покрытием из базальной мембраны и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия.
Через пять дней замените отработанную среду свежей средой для дифференцировки МСК, содержащей 2,5 нанограмма на миллилитр основного фактора роста фибробластов, и продолжайте дифференцировку MCS до 11 и 15 дней. Когда пластинчатые эмбриональные тела достигнут слияния от 80 до 90%, пропустите их, промыв DPBS, добавив трипсин-ЭДТА и инкубируя при 37 градусах Цельсия в течение одной минуты. Снимите трипсин-ЭДТА с тарелки и снова инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одной минуты.
Далее добавьте по одному миллилитру носителя на лунку. Через три минуты соберите клетки с помощью среды для дифференцировки MSC в 15-миллилитровую коническую пробирку и центрифугируйте клетки. Затем ресуспендируют клетки в среде дифференцировки МСК, содержащей основной фактор роста фибробластов, и помещают клетки на пластины, покрытые матричным покрытием базальной мембраны, в соотношении один к трем.
После того, как МСК достигнут 90% слияния, продолжайте культивировать их еще 48 часов, чтобы позволить им пройти период остановки роста. Затем удалите среду и промойте ячейки ДАБС. После промывки добавьте в пластину полную среду для дифференцировки адипоцитов и инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия.
Меняйте среду через день в течение 14 дней. Дифференцировать МСК, полученные из iPSC, в адипоциты. Чтобы отсортировать адипоциты с использованием нильского красного, приготовьте нильский красный рабочий раствор в ДМСО, как описано в текстовой рукописи.
Перед использованием разморозьте исходный раствор и восстановите его в DPBS для достижения концентрации рабочего раствора 300 нмоль. На 14-й день дифференцировки адипоцитов или после него удалите среду из клеток и промойте с помощью DPBS. Затем добавьте рабочий раствор нильского красного.
Накройте тарелку и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов по Цельсию. Через 15 минут замените раствор нильского красного трипсином-ЭДТА и инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия в течение четырех минут. Затем соберите клетки с помощью DMEM, содержащего 5% FBS, в 15-миллилитровую коническую пробирку и центрифугируйте клетки.
Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в DPBS с плотностью 1 миллион клеток на миллилитр. Затем, используя сортировщик FACS, изолируйте нильские красные положительные клетки с помощью канала FL-1. Собирают отсортированные клетки и пересаживают их в среды для дифференцировки адипоцитов или приступают к выделению РНК с последующим количественным анализом маркеров дифференцировки адипоцитов.
При начале дифференцировки клетки, покрытые суспензией, имеют круглую форму с определенными границами клеток и имеют малый или средний размер в диаметре. Жизнеспособность эмбриональных тел наблюдается по быстрому пролиферативному поведению, приводящему к появлению большего количества МСК. Это быстрое поведение пролиферации, наряду с их своеобразной и удлиненной морфологией, сохраняется даже после прохождения МСК на свежие пластины с матричным покрытием.
Хорошая дифференцировка дает надежные МСК с эффективностью экспрессии мезенхимальных поверхностных маркеров CD73, CD44 и CD90 более 90%. Кроме того, оценка клеток на отсутствие поверхностных маркеров, изображающих гемопоэтический фенотип CD14, CD34 и CD19, показала эффективность экспрессии менее 1%, высокая экспрессия в цитоплазматическом распределении FABP4, маркера терминально-дифференцированных адипоцитов, указывает на их зрелость развития. Кроме того, высокая экспрессия адипонектина, еще одного маркера зрелости адипоцитов, указывает на то, что адипоциты достаточно функциональны, чтобы подвергаться накоплению липидов и адипогенезу в ответ на передачу сигналов глюкозы.
После окрашивания нильский красный связывается исключительно с липидоносными зрелыми адипоцитами, что делает его эффективным инструментом для сортировки зрелых адипоцитов с помощью флуоресцентно-активированной проточной цитометрии. Нильские красные положительные клетки демонстрируют значительное повышение маркеров созревания, по крайней мере, в два раза по сравнению с несортированными клетками. Вы должны быть очень осторожны при сборе клеток во время формирования эмбрионального тела и диссоциации мезенхимальных клеток, так как это сильно повлияет на эффективность выживания после диссоциации мезенхимальных стволовых клеток.
Чистая популяция адипоцитов, полученная от пациентов с мутациями, может быть подвергнута функциональному секвенированию и секвенированию всего транскриптома для определения регуляторных и сигнальных путей, затронутых конкретной мутацией, без влияния гетерогенности образца на данные. Этот метод позволит масштабировать генерацию мезенхимальных стволовых клеток in vitro, устраняя необходимость сбора их у доноров человека, чтобы легко дифференцировать их в адипоциты, хондроциты и остеоциты для понимания патогенеза заболеваний, связанных с тканью.
