Los enfoques anteriores se basaban en métodos altamente invasivos para obtener células madre mesenquimales in vitro, pero esas células madre mesenquimales tenían la limitación de producir un grupo heterogéneo del 30% con una eficiencia que oscilaba entre el 30 y el 60%. Cuando las iPSCs hayan alcanzado el 80% de confluencia, lavar las células con DPBS y añadir medio de disociación que contenga EDTA. Incubar las células a 37 grados centígrados durante un minuto.
Después de un minuto, aspire el reactivo de disociación y coloque las células a 37 grados centígrados durante un minuto adicional. A continuación, retire la placa de la incubadora. Agregue un mililitro de medios StemFlex por pocillo y recoja cuidadosamente las células en un tubo cónico de 15 mililitros.
Centrifugar las células. Retire el sobrenadante y vuelva a suspenderlo suavemente en tres mililitros de medios de diferenciación MSC que contengan 10 micromoles de un inhibidor de roca. Mezcle la suspensión celular y distribuya 500 microlitros por pocillo en una placa de fijación ultra baja de 24 pocillos.
Luego coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados. Después de 24 horas, para inducir los cuerpos embrionarios alcanzados, recójalos en un tubo de 15 mililitros y deje que se asienten. Después de 15 minutos, retire el sobrenadante y agregue el medio de diferenciación MSC suplementado con 10 ácido retinoico micromolar.
Resuspenda suavemente los cuerpos embrionarios y distribuya 500 microlitros por pocillo en la misma placa de fijación ultra baja de 24 pocillos. Luego coloque la placa en la incubadora. Después de 48 horas, recoja los cuerpos embrionarios en un tubo de 15 mililitros y déjelos asentarse durante 15 minutos.
A continuación, retire el sobrenadante y agregue el medio de diferenciación MSC suplementado con ácido retinoico micromolar 0.1. Después de resuspender los cuerpos embrionarios, distribuir 500 microlitros por pocillo en la misma placa de 24 pocillos y colocar la placa en la incubadora. Cuarenta y ocho horas después del último tratamiento con ácido retinoico, recolecte los cuerpos embrionarios, retire el sobrenadante y agregue DMEM medio bajo en glucosa sin citoquinas.
Resuspenda suavemente y distribuya 500 microlitros de la suspensión celular por pocillo en la misma placa de fijación ultra baja de 24 pocillos, luego incube la placa a 37 grados centígrados. Después de 48 horas, para emplatar los cuerpos embrionarios derivados de iPSC, recolecte los cuerpos embrionarios en un tubo de 15 mililitros, déjelos asentar, luego retire el sobrenadante y vuelva a suspender en dos mililitros de medio de diferenciación MSC fresco. A continuación, transfiera la suspensión a dos pocillos de una placa de seis pocillos recubierta con matriz de membrana basal e incube las células a 37 grados centígrados.
Después de cinco días, reemplace el medio gastado con un nuevo medio de diferenciación MSC que contenga 2,5 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento de fibroblastos básico y continúe la diferenciación de MCS durante un máximo de 11 y 15 días. Cuando los cuerpos embrionarios en placas hayan alcanzado el 80 al 90% de confluencia, pasarlos lavándolos con DPBS, agregando tripsina-EDTA e incubando a 37 grados centígrados durante un minuto. Retire la tripsina-EDTA de la placa e incube de nuevo a 37 grados centígrados durante un minuto.
A continuación, agregue un mililitro de medios por pozo. Después de tres minutos, recolecte las células usando medios de diferenciación MSC en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue las células. Luego resuspenda las células en un medio de diferenciación MSC que contenga factor de crecimiento de fibroblastos básico y coloque las células en placas recubiertas de matriz de membrana basal en una proporción de uno a tres.
Después de que las MSC hayan alcanzado el 90% de confluencia, continúe cultivándolas durante otras 48 horas para permitir que se sometan a un período de detención del crecimiento. Luego retire el medio y lave las células con DBPS. Después del lavado, agregue un medio de diferenciación adipocitaria completa a la placa e incube las células a 37 grados centígrados.
Cambie el medio cada dos días durante 14 días. Diferenciar las MSC derivadas de iPSC en adipocitos. Para clasificar los adipocitos usando rojo del Nilo, prepare la solución de trabajo del rojo del Nilo en DMSO como se describe en el texto manuscrito.
Antes de su uso, descongele la solución madre y reconstituya en DPBS para alcanzar una concentración de solución de trabajo de 300 nanomolares. En o después del día 14 de diferenciación de adipocitos, deseche el medio de las células y lave con DPBS. Luego agregue la solución de trabajo rojo del Nilo.
Cubra el plato e incube las células a 37 grados centígrados. Después de 15 minutos, reemplace la solución roja del Nilo con tripsina-EDTA e incube las células a 37 grados centígrados durante cuatro minutos. Luego recolecte las células usando DMEM que contiene 5% FBS en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue las células.
Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en DPBS a una densidad de 1 millón de células por mililitro. Luego, utilizando el clasificador FACS, aísle las células rojas positivas del Nilo utilizando el canal FL-1. Recolectar las células clasificadas y recultivarlas en medios de diferenciación de adipocitos o proceder a la extracción de ARN seguida de un análisis cuantitativo de los marcadores de diferenciación de adipocitos.
Al iniciar la diferenciación, las células chapadas en suspensión son redondas con bordes celulares definidos y son de tamaño pequeño a mediano en diámetro. La viabilidad de los cuerpos embrionarios se observa por el comportamiento de rápida proliferación que da lugar a más MSC. Este comportamiento de rápida proliferación, junto con su morfología peculiar y alargada, se conserva incluso después de pasar las MSC a placas recubiertas de matriz fresca.
Una buena diferenciación produce MSC confiables con una eficiencia de expresión superior al 90% de los marcadores de superficie mesenquimales CD73, CD44 y CD90. Además, la evaluación de las células para la ausencia de marcadores de superficie que representan el fenotipo hematopoyético CD14, CD34 y CD19 mostró menos del 1% de eficiencia de expresión, La alta expresión en la distribución citoplasmática de FABP4, un marcador para adipocitos terminalmente diferenciados, indica su madurez de desarrollo. Además, la alta expresión de adiponectina, otro marcador de madurez de los adipocitos, indica que los adipocitos son lo suficientemente funcionales como para someterse al almacenamiento de lípidos y la adipogénesis en respuesta a la señalización de la glucosa.
Tras la tinción, el rojo del Nilo se une exclusivamente a los adipocitos maduros que contienen lípidos, lo que lo convierte en una herramienta efectiva para clasificar los adipocitos maduros utilizando citometría de flujo activada por fluorescencia. Las células rojas positivas del Nilo muestran una regulación positiva significativa de los marcadores de maduración en al menos el doble en comparación con las células no clasificadas. Debe ser muy cuidadoso al recolectar células durante la formación del cuerpo embrionario y la disociación de células mesenquimales, ya que eso tendría un gran impacto en la eficiencia de supervivencia posterior a la disociación de las células madre mesenquimales.
La población pura de adipocitos obtenida de pacientes portadores de mutaciones puede someterse a la secuenciación funcional y del transcriptoma completo para determinar las vías reguladoras y de señalización afectadas por una mutación particular sin que los datos se vean afectados por la heterogeneidad de la muestra. Esta técnica permitirá la generación escalable de células madre mesenquimales in vitro, eliminando la necesidad de cosecharlas de donantes humanos para diferenciarlas fácilmente en adipocitos, condrocitos y osteocitos para comprender la patogénesis de la enfermedad relacionada con los tejidos.
