Les approches précédentes reposaient sur des méthodes hautement invasives pour obtenir des cellules souches mésenchymateuses in vitro, mais ces cellules souches mésenchymateuses avaient une limitation de production d’un pool hétérogène de 30% avec une efficacité allant de 30 à 60%Ici, nous présentons un protocole pour produire un grand nombre de cellules souches mésenchymateuses à prolifération rapide qui peuvent produire une population pure d’adipocytes matures par tri en utilisant le rouge du Nil. Lorsque les CSPi ont atteint 80% de confluence, laver les cellules avec DPBS et ajouter un milieu de dissociation contenant de l’EDTA. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant une minute.
Après une minute, aspirez le réactif de dissociation et placez les cellules à 37 degrés Celsius pendant une minute supplémentaire. Ensuite, retirez la plaque de l’incubateur. Ajouter un millilitre de média StemFlex par puits et recueillir soigneusement les cellules dans un tube conique de 15 millilitres.
Centrifuger les cellules. Retirer le surnageant et le remettre délicatement en suspension dans trois millilitres de milieu de différenciation MSC contenant 10 micromoles d’un inhibiteur de roche. Mélangez la suspension cellulaire et répartissez 500 microlitres par puits dans une plaque de fixation ultra-basse de 24 puits.
Ensuite, placez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Après 24 heures, pour induire les corps embryonnaires atteints, recueillez-les dans un tube de 15 millilitres et laissez-les se déposer. Après 15 minutes, retirer le surnageant et ajouter le milieu de différenciation MSC complété par 10 micromolaires d’acide rétinoïque.
Remettez doucement en suspension les corps embryonnaires et répartissez 500 microlitres par puits dans la même plaque de fixation ultra-basse de 24 puits. Placez ensuite l’assiette dans l’incubateur. Après 48 heures, recueillez les corps embryonnaires dans un tube de 15 millilitres et laissez-les s’installer pendant 15 minutes.
Retirez ensuite le surnageant et ajoutez le milieu de différenciation MSC complété par 0,1 micromolaire d’acide rétinoïque. Après avoir remis en suspension les corps embryonnaires, répartir 500 microlitres par puits dans la même plaque de 24 puits et placer la plaque dans l’incubateur. Quarante-huit heures après le dernier traitement à l’acide rétinoïque, prélever les corps embryonnaires, retirer le surnageant et ajouter un milieu DMEM à faible teneur en glucose sans cytokines.
Remettez doucement en suspension et répartissez 500 microlitres de la suspension cellulaire par puits dans la même plaque de fixation ultra-basse de 24 puits, puis incuber la plaque à 37 degrés Celsius. Après 48 heures, pour plaquer les corps embryonnaires dérivés de l’iPSC, recueillir les corps embryonnaires dans un tube de 15 millilitres, les laisser se déposer, puis retirer le surnageant et les remettre en suspension dans deux millilitres de milieu de différenciation MSC frais. Ensuite, transférez la suspension dans deux puits d’une plaque à six puits revêtue d’une matrice de membrane basale et incuber les cellules à 37 degrés Celsius.
Après cinq jours, remplacer le milieu usé par un nouveau milieu de différenciation MSC contenant 2,5 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance des fibroblastes basiques et poursuivre la différenciation MCS jusqu’à 11 et 15 jours. Lorsque les corps embryonnaires plaqués ont atteint 80 à 90% de confluence, passez-les en les lavant avec du DPBS, en ajoutant de la trypsine-EDTA et en les incubant à 37 degrés Celsius pendant une minute. Retirer la trypsine-EDTA de la plaque et incuber à nouveau à 37 degrés Celsius pendant une minute.
Ensuite, ajoutez un millilitre de média par puits. Après trois minutes, recueillir les cellules à l’aide du milieu de différenciation MSC dans un tube conique de 15 millilitres et centrifuger les cellules. Ensuite, remettez les cellules en suspension dans un milieu de différenciation MSC contenant le facteur de croissance basique des fibroblastes et plaquez les cellules sur des plaques recouvertes de matrice membranaire basale dans un rapport de un à trois.
Une fois que les CSM ont atteint 90% de confluence, continuez à les cultiver pendant 48 heures supplémentaires pour leur permettre de subir une période d’arrêt de la croissance. Ensuite, retirez le milieu et lavez les cellules avec DBPS. Après le lavage, ajoutez un milieu de différenciation adipocytaire complet dans la plaque et incuber les cellules à 37 degrés Celsius.
Changez le support tous les deux jours pendant 14 jours. Différencier les CSM dérivées des CSPi en adipocytes. Pour trier les adipocytes en utilisant le rouge du Nil, préparer la solution de travail rouge du Nil dans le DMSO comme décrit dans le manuscrit du texte.
Avant utilisation, décongeler la solution mère et la reconstituer dans du DPBS pour obtenir une concentration de solution de travail de 300 nanomolaires. À partir du jour 14 de la différenciation des adipocytes, éliminer le milieu des cellules et laver à l’aide de DPBS. Ajoutez ensuite la solution de travail rouge du Nil.
Couvrir la plaque et incuber les cellules à 37 degrés Celsius. Après 15 minutes, remplacez la solution de rouge du Nil par de la trypsine-EDTA et incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant quatre minutes. Ensuite, collectez les cellules à l’aide de DMEM contenant 5% de FBS dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez les cellules.
Retirez le surnageant et remettez en suspension les cellules dans DPBS à une densité de 1 million de cellules par millilitre. Ensuite, à l’aide du trieur FACS, isolez les cellules rouges positives du Nil à l’aide du canal FL-1. Recueillir les cellules triées et les recultiver dans des milieux de différenciation adipocytaire ou procéder à une extraction d’ARN suivie d’une analyse quantitative des marqueurs de différenciation adipocytes.
Lors de l’initiation de la différenciation, les cellules plaquées en suspension sont rondes avec des bordures cellulaires définies et ont un diamètre petit à moyen. La viabilité des corps embryonnaires est observée par le comportement de prolifération rapide donnant naissance à plus de CSM. Ce comportement de prolifération rapide, ainsi que leur morphologie particulière et allongée, sont conservés même après le passage des CSM sur de nouvelles plaques recouvertes de matrice.
Une bonne différenciation produit des CSM fiables avec une efficacité d’expression supérieure à 90% des marqueurs de surface mésenchymateux CD73, CD44 et CD90. En outre, l’évaluation des cellules pour l’absence de marqueurs de surface représentant le phénotype hématopoïétique CD14, CD34 et CD19 a montré une efficacité d’expression inférieure à 1%, Une expression élevée dans la distribution cytoplasmique de FABP4, un marqueur des adipocytes différenciés en phase terminale, indique leur maturité développementale. De plus, une expression élevée de l’adiponectine, un autre marqueur de la maturité adipocytaire, indique que les adipocytes sont suffisamment fonctionnels pour subir un stockage lipidique et une adipogenèse en réponse à la signalisation du glucose.
Lors de la coloration, le rouge du Nil se lie exclusivement aux adipocytes matures porteurs de lipides, ce qui en fait un outil efficace pour trier les adipocytes matures à l’aide de la cytométrie en flux activée par fluorescence. Les cellules rouges positives du Nil montrent une régulation positive significative des marqueurs de maturation d’au moins deux fois par rapport aux cellules non triées. Vous devez être très doux lors de la collecte de cellules pendant la formation du corps embryonnaire et la dissociation des cellules mésenchymateuses, car cela aurait un impact important sur l’efficacité de survie après la dissociation des cellules souches mésenchymateuses.
La population pure d’adipocytes obtenue à partir de patients porteurs de mutations peut être soumise à un séquençage fonctionnel et au séquençage complet du transcriptome pour déterminer les voies de régulation et de signalisation affectées par une mutation particulière sans que les données soient affectées par l’hétérogénéité de l’échantillon. Cette technique permettra la génération évolutive de cellules souches mésenchymateuses in vitro, éliminant ainsi la nécessité de les prélever auprès de donneurs humains pour les différencier facilement en adipocytes, chondrocytes et ostéocytes pour comprendre la pathogenèse des maladies liées aux tissus.
