Bisherige Ansätze stützten sich auf hochinvasive Methoden zur Gewinnung mesenchymaler Stammzellen in vitro, aber diese mesenchymalen Stammzellen hatten eine Begrenzung der Produktion eines heterogenen Pools von 30% mit einer Effizienz von 30 bis 60%. Hier stellen wir ein Protokoll zur Herstellung einer hohen Anzahl schnell proliferierender mesenchymaler Stammzellen vor, die durch Sortierung mit Nilrot eine reine Population reifer Adipozyten erzeugen können. Wenn die iPS-Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, waschen Sie die Zellen mit DPBS und fügen Sie EDTA-haltiges Dissoziationsmedium hinzu. Inkubieren Sie die Zellen eine Minute lang bei 37 Grad Celsius.
Aspirieren Sie nach einer Minute das Dissoziationsreagenz und platzieren Sie die Zellen für eine weitere Minute bei 37 Grad Celsius. Nehmen Sie als Nächstes die Platte aus dem Inkubator. Geben Sie einen Milliliter StemFlex-Medien pro Vertiefung hinzu und sammeln Sie die Zellen vorsichtig in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen.
Zentrifugieren Sie die Zellen. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn vorsichtig in drei Millilitern MSC-Differenzierungsmedien, die 10 Mikromol eines Gesteinsinhibitors enthalten. Mischen Sie die Zellsuspension und verteilen Sie 500 Mikroliter pro Vertiefung in einer 24-Well-Ultra-Low-Attachment-Platte.
Stellen Sie den Teller dann bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator. Nach 24 Stunden, um die erhaltenen embryonalen Körper zu induzieren, sammeln Sie sie in einem 15-Milliliter-Röhrchen und lassen Sie sie sich beruhigen. Entfernen Sie nach 15 Minuten den Überstand und fügen Sie MSC-Differenzierungsmedium hinzu, das mit 10 Mikromolaren Retinsäure ergänzt ist.
Resuspendieren Sie die Embryonalkörper vorsichtig und verteilen Sie 500 Mikroliter pro Well in derselben 24-Well-Platte mit extrem niedrigem Anhang. Legen Sie dann die Platte in den Inkubator. Nach 48 Stunden werden die Embryonalkörper in einem 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt und 15 Minuten ruhen gelassen.
Anschließend wird der Überstand entfernt und MSC-Differenzierungsmedium mit 0,1 Mikromolar Retinsäure zugegeben. Nach der Resuspendierung der Embryonalkörper verteilen Sie 500 Mikroliter pro Vertiefung in derselben 24-Well-Platte und legen Sie die Platte in den Inkubator. Achtundvierzig Stunden nach der letzten Retinsäurebehandlung sammeln Sie die Embryonalkörper, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie DMEM-Medium mit niedrigem Glukosegehalt ohne Zytokine hinzu.
500 Mikroliter der Zellsuspension pro Well werden vorsichtig resuspendiert und in derselben 24-Well-Platte mit extrem niedrigem Anhaftungsgrad verteilt, dann wird die Platte bei 37 Grad Celsius inkubiert. Nach 48 Stunden werden die Embryonalkörper in einem 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt, um die aus iPSC gewonnenen Embryonalkörper zu plattieren, sie absetzen zu lassen, dann den Überstand zu entfernen und in zwei Millilitern frischem MSC-Differenzierungsmedium zu resuspendieren. Als nächstes wird die Suspension in zwei Vertiefungen einer mit einer Basalmembranmatrix beschichteten Sechs-Well-Platte überführt und die Zellen bei 37 Grad Celsius inkubiert.
Ersetzen Sie nach fünf Tagen das verbrauchte Medium durch ein frisches MSC-Differenzierungsmedium, das 2,5 Nanogramm pro Milliliter basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors enthält, und setzen Sie die MCS-Differenzierung bis zu 11 und 15 Tage lang fort. Wenn die plattierten Embryonalkörper eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreicht haben, passieren Sie sie, indem Sie sie mit DPBS waschen, Trypsin-EDTA hinzufügen und eine Minute lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Das Trypsin-EDTA von der Platte nehmen und erneut bei 37 Grad Celsius für eine Minute inkubieren.
Als nächstes fügen Sie ein Milliliter-Medium pro Vertiefung hinzu. Nach drei Minuten werden die Zellen mit MSC-Differenzierungsmedien in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen entnommen und zentrifugiert. Anschließend werden die Zellen in einem MSC-Differenzierungsmedium mit basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor resuspendiert und die Zellen im Verhältnis eins zu drei auf mit Basalmembranmatrix beschichteten Platten plattiert.
Nachdem die MSCs eine Konfluenz von 90 % erreicht haben, kultivieren Sie sie weitere 48 Stunden, damit sie eine Phase des Wachstumsstopps durchlaufen können. Entfernen Sie dann das Medium und waschen Sie die Zellen mit DBPS. Nach dem Waschen geben Sie das vollständige Adipozyten-Differenzierungsmedium auf die Platte und inkubieren die Zellen bei 37 Grad Celsius.
Wechseln Sie das Medium 14 Tage lang jeden zweiten Tag. Differenzierung von iPSC-abgeleiteten MSCs in Adipozyten. Um die Adipozyten mit Nilrot zu sortieren, bereiten Sie Nilrot-Arbeitslösung in DMSO vor, wie im Textmanuskript beschrieben.
Tauen Sie die Stammlösung vor der Verwendung auf und rekonstituieren Sie sie in DPBS, um eine Arbeitslösungskonzentration von 300 Nanomolar zu erreichen. Am oder nach dem 14. Tag der Adipozytendifferenzierung wird das Medium aus den Zellen verworfen und mit DPBS gewaschen. Fügen Sie dann Nilrote Arbeitslösung hinzu.
Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie nach 15 Minuten die Nilrotlösung durch Trypsin-EDTA und inkubieren Sie die Zellen vier Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Sammeln Sie dann die Zellen mit DMEM mit 5%FBS in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen.
Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in DPBS mit einer Dichte von 1 Million Zellen pro Milliliter. Isolieren Sie dann mit dem FACS-Sortierer die roten Nil-positiven Zellen mit dem FL-1-Kanal. Sammeln Sie die sortierten Zellen und kultivieren Sie sie in Adipozyten-Differenzierungsmedien oder fahren Sie mit der RNA-Extraktion fort, gefolgt von einer quantitativen Analyse der Adipozyten-Differenzierungsmarker.
Nach Beginn der Differenzierung sind die in Suspension plattierten Zellen rund mit definierten Zellrändern und haben einen kleinen bis mittleren Durchmesser von kleiner bis mittlerer Größe. Die Lebensfähigkeit embryonaler Körper wird durch das schnelle Proliferationsverhalten beobachtet, das zu mehr MSCs führt. Dieses schnelle Proliferationsverhalten, zusammen mit ihrer eigentümlichen und länglichen Morphologie, bleibt auch nach dem Passieren der MSCs auf frischen, matrixbeschichteten Platten erhalten.
Eine gute Differenzierung führt zu zuverlässigen MSCs mit einer Expressionseffizienz von mehr als 90% der mesenchymalen Oberflächenmarker CD73, CD44 und CD90. Darüber hinaus ergab die Untersuchung von Zellen auf das Fehlen von Oberflächenmarkern, die den hämatopoetischen Phänotyp CD14, CD34 und CD19 darstellen, eine Expressionseffizienz von weniger als 1%. Eine hohe Expression in der zytoplasmatischen Verteilung von FABP4, einem Marker für terminal differenzierte Adipozyten, deutet auf ihre Entwicklungsreife hin. Darüber hinaus deutet eine hohe Expression von Adiponektin, einem weiteren Marker der Adipozytenreife, darauf hin, dass die Adipozyten funktionsfähig genug sind, um als Reaktion auf die Glukosesignalisierung eine Lipidspeicherung und Adipogenese zu durchlaufen.
Bei der Färbung bindet Nilrot ausschließlich an die lipidtragenden reifen Adipozyten, was es zu einem effektiven Werkzeug für die Sortierung reifer Adipozyten mittels fluoreszenzaktivierter Durchflusszytometrie macht. Die Nilrot-positiven Zellen zeigen eine signifikante Hochregulation der Reifungsmarker um mindestens das Doppelte im Vergleich zu unsortierten Zellen. Bei der Entnahme von Zellen während der embryonalen Körperbildung und der Dissoziation von mesenchymalen Zellen muss man sehr vorsichtig vorgehen, da dies die Überlebenseffizienz nach der Dissoziation von mesenchymalen Stammzellen stark beeinträchtigen würde.
Reine Populationen von Adipozyten, die von mutationstragenden Patienten gewonnen wurden, können einer funktionellen und der gesamten Transkriptomsequenzierung unterzogen werden, um regulatorische und Signalwege zu bestimmen, die von einer bestimmten Mutation betroffen sind, ohne dass die Daten durch die Heterogenität der Proben beeinflusst werden. Diese Technik ermöglicht eine skalierbare Erzeugung von mesenchymalen Stammzellen in vitro, so dass sie nicht mehr von menschlichen Spendern entnommen werden müssen, um sie leicht in Adipozyten, Chondrozyten und Osteozyten zu differenzieren, um die Pathogenese von gewebebedingten Krankheiten zu verstehen.
