Abordagens anteriores se baseavam em métodos altamente invasivos para a obtenção de células-tronco mesenquimais in vitro, mas essas células-tronco mesenquimais tinham uma limitação de produzir pool heterogêneo de 30% com eficiência variando de 30 a 60%Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um alto número de células-tronco mesenquimais de proliferação rápida que podem produzir uma população pura de adipócitos maduros por triagem usando vermelho do Nilo. Quando as iPSCs atingirem 80% de confluência, lavar as células com DPBS e adicionar meio de dissociação contendo EDTA. Incubar as células a 37 graus Celsius por um minuto.
Após um minuto, aspirar o reagente de dissociação e colocar as células a 37 graus Celsius por mais um minuto. Em seguida, retire a placa da incubadora. Adicione um mililitro de meio StemFlex por poço e colete cuidadosamente as células em um tubo cônico de 15 mililitros.
Centrifugar as células. Retire o sobrenadante e ressuspenda-o suavemente em três mililitros de meio de diferenciação MSC contendo 10 micromoles de um inibidor de rocha. Misture a suspensão celular e distribua 500 microlitros por poço em uma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços.
Em seguida, coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius. Após 24 horas, para induzir os corpos embrionários atingidos, colete-os em um tubo de 15 mililitros e permita que eles se acomodem. Após 15 minutos, retirar o sobrenadante e adicionar meio de diferenciação MSC suplementado com ácido retinóico 10 micromolares.
Ressuspenda os corpos embrionários suavemente e distribua 500 microlitros por poço na mesma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços. Em seguida, coloque a placa na incubadora. Após 48 horas, colete os corpos embrionários em um tubo de 15 mililitros e deixe-os se acomodar por 15 minutos.
Em seguida, remova o sobrenadante e adicione o meio de diferenciação MSC suplementado com ácido retinóico 0,1 micromolar. Após ressuspender os corpos embrionários, distribua 500 microlitros por poço na mesma placa de 24 poços e coloque a placa na incubadora. Quarenta e oito horas após o último tratamento com ácido retinóico, coletar os corpos embrionários, remover o sobrenadante e adicionar meio DMEM de baixa glicose sem citocinas.
Ressuspenda suavemente e distribua 500 microlitros da suspensão celular por poço na mesma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços e, em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius. Após 48 horas, para plaquear os corpos embrionários derivados da iPSC, coletar os corpos embrionários em um tubo de 15 mililitros, deixá-los se acomodar, remover o sobrenadante e ressuspender em dois mililitros de meio fresco de diferenciação de CTM. Em seguida, transfira a suspensão para dois poços de uma placa de seis poços revestida com matriz de membrana basal e incube as células a 37 graus Celsius.
Após cinco dias, substituir o meio gasto por um meio fresco de diferenciação de CTM contendo 2,5 nanogramas por mililitro de fator de crescimento básico de fibroblastos e continuar a diferenciação de CMS por até 11 e 15 dias. Quando os corpos embrionários plaqueados atingirem 80 a 90% de confluência, passe-os lavando com DPBS, adicionando tripsina-EDTA e incubando a 37 graus Celsius por um minuto. Retire a tripsina-EDTA da placa e incube novamente a 37 graus Celsius por um minuto.
Em seguida, adicione um mililitro de mídia por poço. Após três minutos, coletar as células usando meios de diferenciação de CTM em um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugar as células. Em seguida, ressuspender as células em um meio de diferenciação de CTM contendo fator de crescimento básico de fibroblastos e plaquear as células em placas revestidas com matriz de membrana basal na proporção de um para três.
Depois que as CTMs atingirem 90% de confluência, continue cultivando-as por mais 48 horas para permitir que elas passem por um período de parada de crescimento. Em seguida, remova o meio e lave as células com DBPS. Após a lavagem, adicionar meio de diferenciação completa de adipócitos à placa e incubar as células a 37 graus Celsius.
Troque o meio a cada dois dias por 14 dias. Diferenciar CTMs derivadas de iPSC em adipócitos. Para classificar os adipócitos usando vermelho do Nilo, prepare a solução de trabalho vermelho do Nilo em DMSO, conforme descrito no manuscrito do texto.
Antes do uso, descongelar a solução estoque e reconstituí-la em DPBS para atingir uma concentração de solução de trabalho de 300 nanomolares. No ou após o 14º dia de diferenciação dos adipócitos, descartar o meio das células e lavar com DPBS. Em seguida, adicione a solução de trabalho vermelho do Nilo.
Tampe a placa e incube as células a 37 graus Celsius. Após 15 minutos, substituir a solução vermelha do Nilo por tripsina-EDTA e incubar as células a 37 graus Celsius por quatro minutos. Em seguida, colete as células usando DMEM contendo 5% FBS em um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue as células.
Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em DPBS a uma densidade de 1 milhão de células por mililitro. Em seguida, usando o classificador FACS, isole as células vermelhas positivas do Nilo usando o canal FL-1. Coletar as células selecionadas e recultivá-las em meios de diferenciação de adipócitos ou proceder à extração de RNA seguida de análise quantitativa dos marcadores de diferenciação de adipócitos.
Ao iniciar a diferenciação, as células plaqueadas em suspensão são redondas com bordas celulares definidas e de pequeno a médio diâmetro de diâmetro. A viabilidade dos corpos embrionários é observada pelo rápido comportamento de proliferação, dando origem a mais CTMs. Esse comportamento de proliferação rápida, juntamente com sua morfologia peculiar e alongada, é mantido mesmo após a passagem das CTMs para placas revestidas com matriz fresca.
Uma boa diferenciação produz CTMs confiáveis com eficiência de expressão superior a 90% dos marcadores de superfície mesenquimal CD73, CD44 e CD90. Além disso, a avaliação das células quanto à ausência de marcadores de superfície que retratam o fenótipo hematopoético CD14, CD34 e CD19 mostrou eficiência de expressão inferior a 1%, Alta expressão na distribuição citoplasmática de FABP4, um marcador para adipócitos terminalmente diferenciados, indica sua maturidade de desenvolvimento. Além disso, a alta expressão de adiponectina, outro marcador de maturidade dos adipócitos, indica que os adipócitos são funcionais o suficiente para sofrer armazenamento lipídico e adipogênese em resposta à sinalização da glicose.
Após a coloração, o vermelho do Nilo liga-se exclusivamente aos adipócitos maduros portadores de lipídios, tornando-se uma ferramenta eficaz para classificar adipócitos maduros usando citometria de fluxo ativada por fluorescência. As células vermelho-positivas do Nilo mostram um aumento significativo da regulação dos marcadores de maturação em pelo menos duas vezes em comparação com as células não selecionadas. Você tem que ser muito gentil ao coletar células durante a formação do corpo embrionário e dissociação de células mesenquimais, pois isso teria um grande impacto na eficiência de sobrevivência pós-dissociação de células-tronco mesenquimais.
A população pura de adipócitos obtida de pacientes portadores de mutação pode ser submetida ao sequenciamento funcional e ao transcriptoma completo para determinar vias regulatórias e de sinalização afetadas por determinada mutação sem que os dados sejam afetados pela heterogeneidade da amostra. Esta técnica permitirá a geração escalável de células-tronco mesenquimais in vitro, eliminando a necessidade de colhê-las de doadores humanos para diferenciá-las prontamente em adipócitos, condrócitos e osteócitos para o entendimento da patogênese de doenças relacionadas ao tecido.
