البروتوكول مهم في إظهار ضعف حركي لأسماك الزرد والانتعاش اللاحق ، بعد الحقن داخل البطين من السموم العصبية 6-هيدروكسي دوبامين في الدماغ البطني الثنائي. توضح هذه التقنية التغيرات في التأثيرات الوظيفية ، التي تتوافق مع الاستئصال المحدد للخلايا العصبية الدوبامينية في الدماغ البطني لسمك الزرد البالغ المصاب ب 6-OHDA ، باستخدام إعداد بسيط للغاية. قد توفر الدراسات المستقبلية حول الآليات الكامنة وراء التجديد العصبي ، بالإضافة إلى العوامل الداخلية والخارجية التي تعدل العملية ، رؤى مهمة حول استراتيجيات علاج استبدال الخلايا ضد مرض باركنسون.
الحفاظ على الأسماك في خزان مياه معدني مقطر مع غرام واحد لكل لتر من ملح البحر التجاري ، تحت درجة حرارة تحكم تبلغ 28 ، زائد أو ناقص درجة مئوية واحدة. احتضن 25 سمكة كحد أقصى لكل خزان سعة 45 لترا وعرضها للضوء لمدة 14 ساعة وفترة ضوئية مظلمة لمدة 10 ساعات. إطعام الأسماك مرتين على الأقل في اليوم مع كريات الطعام ، مع استكمال مع تجميد الديدان المجففة.
قم بإعداد محلول مخزون من تريكايين ميثان سلفونات ، عن طريق إذابة غرامين ونصف من تريكاين ميثان سلفونات وخمسة غرامات من بيكربونات الصوديوم في 250 ملليلتر من الماء المقطر. تمييع اثنين من ملليلتر من محلول المخزون لجعل 200 ملليلتر من محلول التخدير العامل. تحضير طازج 99.96 ملليمولار 6-هيدروكسي دوبامين ، عن طريق إذابة 0.2 ملليغرام من حمض الأسكوربيك أولا في ملليلتر واحد من 0.9 ٪ من الوزن بواسطة كلوريد الصوديوم المصفى المعقم الحجم.
قم بتصفية الحل باستخدام مرشح 0.2 ميكرون. ثم أضف 25 ملليغرام من 6-هيدروكسي دوبامين ، في شكل مسحوق ، إلى المحلول. ضع السمكة المخدرة على إسفنجة غارقة في الماء ، وضعها تحت مجهر ستيريو ورطب الأسماك بانتظام.
تحديد موضع الحقن ، بناء على التقاطع بين خياطة metopic ، خياطة الإكليل وخياطة السهمية ، وربط الجمجمة الجدارية والأمامية لدماغ الزرد. ثم قم بعمل ثقب صغير بحجم ملليمتر مربع واحد ، باستخدام إبرة قياس 27 حادة. اخفض الحاقن الشعري الدقيق بزاوية 60 درجة ، حتى يصل إلى عمق 1200 ميكرومتر من سقف الجمجمة في جمجمة الزرد.
اضغط على حد Z لإصلاح الموضع. اضبط ضغط الحقن الأولي على 4000 هيكتوباسكال. مدة الحقن في 2.3 ثانية.
ضغط التعويض إلى 10 هيكتوباسكال. خفض شدة الحقن ، مع كل حقنة لاحقة. حقن 0.5 ميكرولتر من 99.96 ملليمولار من السموم العصبية 6-هيدروكسي دوبامين أو 0.9٪ من الوزن حسب الحجم الملحي ، في مجموعة التحكم الوهمية ، واترك الشعيرات الدموية الدقيقة ترتاح لمدة 20 ثانية.
استمر في ترطيب الأسماك بالماء المقطر طوال العملية ، لمنع التجفيف. قم بإزالة الشعيرات الدموية الدقيقة ببطء وقم بإنعاش الأسماك تحت الماء المقطر الجاري. ضع الأسماك في خزان استرداد معزول وأزل أي مشتتات يمكن أن تزعج عملية الاسترداد.
اغسل الشعيرات الدموية الدقيقة قبل الحقن التالي ، لإزالة الانسداد والتأكد من أن شدة الحقن كافية لإنتاج الحجم المطلوب من 0.5 ميكرولتر من 6-هيدروكسي دوبامين. قم بإجراء تقييم حركي لسمك الزرد بشكل فردي ، من خلال اختبار الخزان المفتوح ، في اليوم الثالث واليوم 30 ، بعد 6-hydroxydopamine. ضع الخزان التجريبي ، مع جدرانه المغطاة بالورق الأبيض ، على منصة مرتفعة.
قم بإضاءة الخزان من الأسفل ، باستخدام مصدر ضوء. املأ الخزان بالماء المقطر بنسبة 80 إلى 90٪ وحافظ على درجة الحرارة عند 28 ، زائد أو ناقص درجة مئوية واحدة. قياس درجة الحرارة باستخدام ميزان حرارة وتنظيمها باستخدام سخان حوض السمك التجاري.
بعد دقيقتين على الأقل من التأقلم ، سجل سلوك سباحة الأسماك من وجهة نظر مخططة على المستوى ثنائي الأبعاد للمنطقة التجريبية ، باستخدام كاميرا فيديو لمدة خمس دقائق. لتجنب التناقضات ، في دفعات مختلفة من التسجيلات ، لا تتجاوز 10 دقائق من التأقلم. قم بتحليل مقاطع الفيديو باستخدام برنامج تتبع الفيديو باستخدام بروتوكول الخزان المفتوح ، للحصول على المسافة المقطوعة ومتوسط السرعة لكل موضوع.
قيمت التجربة الحالية التغيرات في سلوك سباحة الزرد البالغ ، بعد الحقن المجهري داخل البطين مع 6-هيدروكسي دوبامين. كانت منطقة الدماغ الرئيسية المثيرة للاهتمام هي الدماغ البطني ، الذي يتكون من منطقة ما قبل النظر ، والسل الخلفي ، وتحت المهاد. تم إزالة أكثر من 85٪ من الخلايا العصبية الدوبامينية المناعية التفاعلية التيروزين هيدروكسيلاز في الدماغ البطني في اليوم الثالث من الآفة.
ثم يزداد عدد الخلايا العصبية المناعية الدوبامينيرية التفاعلية التيروزين هيدروكسيلاز بأكثر من 50٪ في اليوم 14 بعد الآفة ، قبل تحقيق التجديد الكامل لمدة 30 يوما بعد الآفة. وأشار تحليل سلوك سباحة الزرد، باستخدام برنامج تتبع الفيديو، إلى أن متوسط السرعة والمسافة المقطوعة للمجموعة المصابة، في اليوم الثالث من الآفة، قد انخفض بشكل كبير إلى أقل من 45٪ بالمقارنة مع الوهمية. أظهرت المجموعة المصابة تعافيا للوظيفة الحركية ، بعد 30 يوما من الآفة ، مع عدم وجود فرق كبير في متوسط السرعة أو المسافة المقطوعة ، عند مقارنتها بالوهمية.
من المهم إجراء التقييم الحركي ضمن إطار زمني محدد. على سبيل المثال، من الساعة 8:00 صباحا حتى الساعة 12:00 ظهرا. وحافظت درجة حرارة الماء على 28 درجة مئوية، طوال التجربة. يمكن إجراء اختبارات سلوكية أخرى ، مثل المياه الضحلة والسلوكيات الشبيهة بالقلق ، لاستكشاف تغييرات إضافية أو تأثيرات وظيفية لاستئصال الخلايا العصبية الدوبامينية ، بعد حقن 6-OHDA في دماغ الزرد البالغ.
