يوفر هذا البروتوكول طريقة لإنتاج عدة مئات من الكرويات السرطانية متعددة الخلايا في كل بئر من صفيحة بئر متعددة مناسبة للفحص المجهري الآلي. يمكن تصنيف الكروية المنتجة إلى فئات مختلفة الحجم ، ويمكن استخراج المعلومات دون الخلوية من كل خلية. تنتج هذه التقنية أمصال كافية يمكن استخدامها في الفحص المباشر ودراسات تداخل الحمض النووي الريبي.
قم بتخفيف مادة الطابق السفلي ECM في وسط خال من المصل الأحمر البارد باستخدام أطراف مبردة مسبقا محفوظة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. أراهن على 15 ميكرولتر من مادة الطابق السفلي ECM والحل المتوسط في لوحة تصوير 96 بئرا. قم بالطرد المركزي للصفيحة لمدة 20 دقيقة بسرعة 91 مرة G عند أربع درجات مئوية.
احتضن الطبق لمدة لا تزيد عن 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. أضف رحلات و EDTA إلى الخلايا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في نهاية الحضانة ، نقوم بتعليق الخلايا في وسط كامل يحتوي على 10٪ FBS.
ماصة 10 ميكرولتر من تعليق الخلية ، في غرفة عد مقياس الدم. احسب عدد الخلايا في أربعة أرباع الغرفة. ينظر سنترا إلى الخلايا عند 135 مرة G لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة.
واحدة من هذه الخلايا يتم تكويرها ، وشفط supernatant وإعادة تعليق الخلايا في وسط كامل خال من الفينول الأحمر للحصول على تركيز 10 إلى ست خلايا لكل ملليلتر. تمييع الخلايا في وسط كامل خال من الفينول الأحمر. انظر الخلايا بقطرة في حركة دائرية بحجم إجمالي قدره 35 ميكرولتر لكل بئر.
احتضن الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. عند 1.2 ميكرولتر من مادة الطابق السفلي ECM إلى 23.8 ميكرولتر من الفينول الأحمر الخالي من الوسط الكامل لكل بئر ، مما يؤدي إلى حجم نهائي قدره 60 ميكرولتر لكل بئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
في اليوم التالي ، استبدل الوسط ب 100 ميكرولتر من الوسط الكامل الخالي من الفينول الأحمر الطازج. أدخل صفيحة البئر 96 التي تحتوي على كرويات في مجهر فحص عالي المحتوى متحد البؤرة. حدد أشعة الليزر المناسبة لإثارة الأرضيات المستخدمة.
احصل على القنوات بالتتابع لتجنب الحديث المتبادل ، وصور الكرويات باستخدام الأهداف المناسبة. لتحليل مورفولوجيا الكرويات ، قم بتقسيم الكرويات بناء على FLoid المترافق مع الفلورسنت والتلطيخ. قم بتقسيم النوى بناء على سداسي عشري ثلاثة ، ثلاثة ، ثلاثة ، أربعة ، اثنين من التلطيخ.
قسم السيتوبلازم لكل خلية بواسطة السداسي المتبقي ثلاثة ، ثلاثة ، أربعة ، اثنين ، وصمة عار موجودة في سيتوبلازم الخلية. حساب الخصائص المورفولوجية المختلفة للكرويات بما في ذلك الحجم ومساحة السطح والكروية وعدد النوى لكل كرويات. لدى روس صور إضافية لإزالة الكرويات الأصغر من 75 ميكرومتر مكعب وأكبر من 900،000 ميكرومتر مكعب.
لتحليل خلية واحدة داخل الكرويات، قم بتقسيم الكرويات بناء على تلطيخ كروي مترافق مع الفلورسنت. قم بتقسيم النوى بناء على سداسي عشري ثلاثة ، ثلاثة ، ثلاثة ، أربعة ، اثنين من التلطيخ. قم بتقسيم السيتوبلازم لكل خلية بواسطة السداسي المتبقي ثلاثة ، ثلاثة ، ثلاثة ، أربعة ، وصمتين موجودتين في سيتوبلازم الخلية.
قسم الليزوسومات على أساس تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية. حساب الخصائص المورفولوجية المختلفة للخلايا داخل كل كروية، بما في ذلك عدد الليزوسومات لكل خلية وحجم الخلية ومساحة سطح الخلية. يوضح الشكل لمحات عامة جيدة عن ثلاثة أنواع مختلفة من الكرويات ، بما في ذلك الصور في مستويات مختلفة متحدة البؤرة.
كما يتم عرض منظر حجمي للكرويات بأكملها. يوضح الشكل عملية تجزئة الأس الهيدروجيني ، وتعرض اللوحة A الكرويات بأكملها في عرض حجمي. تعرض اللوحة B التقسيم المحدد للسيتوبلازم والنوى والليزوسومات داخل جميع خلايا كروية واحدة.
يتم تقسيم السيتوبلازم والنوى على أساس سداسي عشري ثلاثة ، ثلاثة ، ثلاثة ، أربعة ، اثنين من التلطيخ. ويتم تقسيم الليزوسومات بناء على تلطيخ الأجسام المضادة للمختبر المضاد واحد. تعرض اللوحات C نفس المقطع مثل اللوحة B، ولكن في عرض عادي ثلاثي.
يمكن إجراء قياسات مورفولوجية مختلفة على مستوى الكرويات. وتشمل هذه القياسات حساب عدد النوى لكل كروية، فضلا عن هذه السعادة والحجم ومساحة سطح الرقم الهيدروجيني. الحجم النموذجي لكل خلية في الأنواع الكروية الثلاثة.
وكذلك عدد الليزوسومات لكل خلية موضحة في هذا الشكل. يعد تحسين كثافة المقاعد الأولية للخلايا في بداية جيل SP خطوة حاسمة. يوضح الشكل أن إضافة عدد كبير جدا من الخلايا لا يزال يسمح بتكوين الكرويات.
ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي هذا إلى الانصهار إذا كانت كروية. يمكن أن تخضع الكرويات التي تنتج بهذه الطريقة للتحليل النسخي والبروتيني. تستخدم هذه التقنية للتحليل الكمي لامتصاص توصيل الأدوية مثل هذه الجسيمات النانوية وتقييم سميتها للخلايا الفردية في الكرويات.
