이 프로토콜은 자동화된 현미경 검사에 적합한 다중 웰 플레이트의 각 웰에서 수백 개의 다세포 종양 구상체를 생산하는 방법을 제공한다. 생성 된 스페로이드는 다른 크기 클래스로 분류 될 수 있으며 모든 세포에서 아세포 정보를 추출 할 수 있습니다. 이 기술은 직접 스크리닝 및 RNA 간섭 연구에 사용할 수있는 충분한 혈청을 생산합니다.
ECM 지하실 재료를 차가운 페놀 레드 세럼프리 배지에 희석하여 섭씨 영하 20도에서 유지되는 미리 냉장 팁을 사용하십시오. ECM 지하실 재료와 중간 용액 15 마이크로 리터를 96 웰 이미징 플레이트에 베팅했습니다. 플레이트를 섭씨 네 도에서 91배 G에서 20분 동안 원심분리한다.
플레이트를 섭씨 37도에서 30분 이상 배양하지 않는다. 여행과 EDTA를 셀에 추가하십시오. 인큐베이션이 끝날 때 세포를 섭씨 37도에서 인큐베이션하고, 세포를 10%FBS를 함유하는 완전한 배지에 현탁시킨다.
10 마이크로리터의 세포 현탁액을 혈구계 계수 챔버에 피펫. 챔버의 네 사분면에있는 셀 수를 계산하십시오. 센트라는 실온에서 네 분 동안 135배 G에서 세포를 본다.
이 세포를 펠릿화하고, 상청액을 흡인하고, 세포를 페놀 적색 무함유 완전 배지에 재현탁시켜 밀리리터당 6개의 세포에 10의 농도를 얻는다. 세포를 페놀 적색 유리 완전 배지에 희석한다. 세포를 웰 당 35 마이크로리터의 총 부피로 원형 운동으로 적하하는 것을 본다.
세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소가 있는 가습된 인큐베이터에서 한 시간 동안 배양한다. ECM 지하실 물질의 1.2 마이크로리터에서 웰 당 23.8 마이크로리터의 페놀 레드 프리 완전 매질로, 웰 당 60 마이크로리터의 최종 부피를 초래한다. 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 가습된 인큐베이터에서 배양한다.
다음날 배지를 100 마이크로 리터의 신선한 페놀 레드 프리 완전 배지로 교체하십시오. 구상체가 들어있는 96 웰 플레이트를 공초점 고함량 스크리닝 현미경에 삽입하십시오. 사용 된 바닥을 자극 할 적절한 레이저를 선택하십시오.
누화를 피하기 위해 채널을 순차적으로 획득하고 적절한 목표를 사용하여 구상체를 이미지화하십시오. 구상체의 형태를 분석하기 위해, 형광 접합된 FLoid에 기초하여 구상체를 분절하고 염색한다. 육각 세 개, 세 개, 세 개, 네 개, 두 개의 염색에 기초하여 핵을 분절한다.
각 세포의 세포질을 잔류 육각 세 개, 세 개, 네 개, 두 개, 세포질에 존재하는 염색에 의해 분절한다. 부피, 표면적, 구형도 및 그의 구상체 당 핵의 수를 포함하여 구상체의 다른 형태 학적 특성을 계산하십시오. Ross는 75 입방 마이크로 미터보다 작고 900, 000 입방 마이크로 미터보다 큰 구상체를 제거하는 이미지를 추가로 가지고 있습니다.
구상체 내의 단일 세포를 분석하기 위해, 형광 컨쥬게이션된 스페로이드 염색에 기초하여 구상체를 분절한다. 육각 세 개, 세 개, 세 개, 네 개, 두 개의 염색에 기초하여 핵을 분절한다. 세포질에 존재하는 잔류 육각 세 개, 세 개, 세 개, 네 개, 두 개의 염색에 의해 각 세포의 세포질을 분절한다.
이차 항체 염색에 기초하여 리소좀을 분절한다. 세포당 리소좀의 수, 세포 부피 및 세포 표면적을 포함하여 각 구상체 내의 세포의 상이한 형태학적 특성을 계산한다. 이 그림은 서로 다른 공초점 평면의 이미지를 포함하여 세 가지 유형의 구상체에 대한 개요를 잘 보여줍니다.
전체 구상체의 체적보기도 표시됩니다. 도면은 pH 세분화 과정을 나타내고, 패널 A는 전체 구상체를 부피 관점에서 보여준다. 패널 B는 단일 구상체의 모든 세포 내에서 세포질, 핵 및 리소좀의 세트 세분화를 표시한다.
세포질과 핵은 육각 세 개, 네 개, 두 개의 염색에 기초하여 분절된다. 및 리소좀은 항-항체 염색일 실험실에 기초하여 분절된다. 패널 C는 패널 B와 동일한 세그먼트를 표시하지만 세 개의 일반 보기로 표시됩니다.
구상체 수준에서 다양한 형태학적 측정이 이루어질 수 있다. 이러한 측정에는 구상체 당 핵의 수뿐만 아니라 이들 펠리시티, 부피 및 pH의 표면적의 계산이 포함됩니다. 세 가지 스페로이드 유형에서 각 세포의 전형적인 부피.
세포 당 리소좀의 수뿐만 아니라이 그림에 나와 있습니다. SP 생성 초기에 초기 셀 안착 밀도를 최적화하는 것은 중요한 단계입니다. 그림은 너무 많은 세포를 추가하면 여전히 구상체 형성이 가능하다는 것을 보여줍니다.
그러나, 이것은 구상체 인 경우 융합을 초래할 수 있습니다. 이러한 방식으로 생산된 구상체는 전사체 및 프로테오믹 분석을 거칠 수 있다. 이 기술은 이러한 나노 입자의 약물 전달의 흡수를 정량적으로 분석하고 구상체 내의 개별 세포에 대한 독성을 평가하는 데 사용됩니다.
