Questo protocollo fornisce un metodo per produrre diverse centinaia di sferoidi tumorali multicellulari in ogni pozzetto di una piastra multiplo adatta alla microscopia automatizzata. Gli sferoidi prodotti possono essere classificati in diverse classi di dimensioni e le informazioni subcellulari possono essere estratte da ogni cellula. La tecnica produce sieri sufficienti che possono essere utilizzati nello screening diretto e negli studi di interferenza dell'RNA.
Diluire il materiale seminterrato ECM in mezzo libero da siero rosso fenolo freddo utilizzando punte pre-refrigerate mantenute a meno 20 gradi Celsius. Scommetto 15 microlitri del materiale seminterrato ECM e soluzione media in una piastra di imaging a 96 pozzetti. Centrifugare la piastra per 20 minuti a 91 volte G a quattro gradi Celsius.
Incubare la piastra per non più di 30 minuti a 37 gradi Celsius. Aggiungere viaggi ed EDTA alle celle. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius alla fine dell'incubazione, sospendiamo le cellule in un mezzo completo contenente il 10% di FBS.
Pipettare 10 microlitri della sospensione cellulare, in una camera di conteggio emocitometrica. Contare il numero di celle in quattro quadranti della camera. Centra visualizza le celle a 135 volte G per quattro minuti a temperatura ambiente.
Una di queste cellule vengono pellettate, aspirano il surnatante e risospesgono le cellule in un mezzo completo privo di fenolo rosso per ottenere una concentrazione di 10 alle sei cellule per millilitro. Diluire le cellule in un mezzo completo privo di fenolo rosso. Vedere le celle a goccia in un movimento circolare in un volume totale di 35 microlitri per pozzetto.
Incubare le cellule per un'ora a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica. A 1,2 microlitri di materiale seminterrato ECM a 23,8 microlitri di mezzo completo privo di fenolo rosso per pozzetto, con un volume finale di 60 microlitri per pozzetto. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica.
Il giorno seguente, sostituire il mezzo con 100 microlitri di mezzo completo fresco senza fenolo rosso. Inserire la piastra da 96 pozzetti contenente sferoidi, in un microscopio di screening confocale ad alto contenuto. Selezionare i laser appropriati per eccitare i pavimenti utilizzati.
Acquisire i canali in sequenza per evitare la diafonia, visualizzare gli sferoidi utilizzando obiettivi appropriati. Per analizzare la morfologia degli sferoidi, segmentare gli sferoidi in base al FLoide coniugato fluorescente e alla colorazione. Segmentare i nuclei in base alla colorazione esadecimale tre, tre, tre, quattro, due.
Segmentare il citoplasma di ciascuna cellula con l'esagono residuo tre, tre, quattro, due, macchia che è presente nel citoplasma cellulare. Calcola diverse proprietà morfologiche degli sferoidi tra cui volume, superficie, sfericità e numero di nuclei per i suoi sferoidi. Ross ha ulteriori immagini per rimuovere sferoidi più piccoli di 75 micrometri cubi e più grandi di 900.000 micrometri cubici.
Per analizzare una singola cellula all'interno degli sferoidi, segmentare gli sferoidi in base alla colorazione sferoide coniugata fluorescentemente. Segmentare i nuclei in base alla colorazione esadecimale tre, tre, tre, quattro, due. Segmentare il citoplasma di ciascuna cellula con la colorazione esagonale residua tre, tre, tre, quattro, due che è presente nel citoplasma cellulare.
Segmentare i lisosomi in base alla colorazione secondaria degli anticorpi. Calcola diverse proprietà morfologiche delle cellule all'interno di ciascun sferoide, incluso il numero di lisosomi per cellula, il volume cellulare e l'area della superficie cellulare. La figura mostra una panoramica di tre diversi tipi di sferoidi, comprese le immagini a diversi piani confocali.
Viene anche mostrata una vista volumetrica dell'intero sferoide. La figura mostra il processo di segmentazione del pH, il pannello A mostra l'intero sferoide in una vista volumetrica. Il pannello B mostra la segmentazione impostata del citoplasma, dei nuclei e dei lisosomi all'interno di tutte le cellule di un singolo sferoide.
Il citoplasma e i nuclei sono segmentati in base alla colorazione esadecimale tre, tre, tre, quattro, due. E i lisosomi sono segmentati in base alla colorazione anticorpale anti laboratorio. I pannelli C mostrano lo stesso segmentato del pannello B, ma in una vista a tre piani.
È possibile effettuare varie misurazioni morfologiche a livello di sferoidi. Queste misurazioni includono il calcolo del numero di nuclei per sferoidi, così come questi Felicity, volume e superficie del pH. Il volume tipico di ogni cella nei tre tipi di sferoidi.
Così come il numero di lisosomi per cellula sono mostrati in questa figura. L'ottimizzazione della densità iniziale dei posti a sedere delle celle all'inizio della generazione sp è un passo fondamentale. La figura mostra che l'aggiunta di troppe cellule consente ancora la formazione di sferoidi.
Tuttavia, questo può provocare la fusione se sferoidi. Gli sferoidi prodotti in questo modo possono essere sottoposti ad analisi trascrittomico e proteomica. Questa tecnica viene utilizzata per analizzare quantitativamente l'assorbimento della somministrazione di farmaci tali nano particelle e valutare la loro tossicità per le singole cellule negli sferoidi.
