Ce protocole fournit une méthode pour produire plusieurs centaines de sphéroïdes tumoraux multicellulaires dans chaque puits d’une plaque multi-puits adaptée à la microscopie automatisée. Les sphéroïdes produits peuvent être classés en différentes classes de taille, et les informations subcellulaires peuvent être extraites de chaque cellule. La technique produit suffisamment de sérums qui peuvent être utilisés dans le dépistage direct et les études d’interférence ARN.
Diluer le matériau de sous-sol ECM dans un milieu sans sérum rouge phénol froid à l’aide d’embouts pré-réfrigérés maintenus à moins 20 degrés Celsius. Je parie 15 microlitres du matériau de sous-sol ECM et de la solution moyenne dans une plaque d’imagerie de 96 puits. Centrifuger la plaque pendant 20 minutes à 91 fois G à quatre degrés Celsius.
Incuber la plaque pendant 30 minutes au maximum à 37 degrés Celsius. Ajoutez des voyages et de l’EDTA aux cellules. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius à la fin de l’incubation, nous suspendons les cellules dans un milieu complet contenant 10% de FBS.
Pipette 10 microlitres de la suspension cellulaire, dans une chambre de comptage hémocytomètre. Comptez le nombre de cellules dans quatre quadrants de la chambre. Centra visualise les cellules à 135 fois G pendant quatre minutes à température ambiante.
Une fois ces cellules sont agglomérées, aspirent le surnageant et ressuscitent les cellules dans un milieu complet sans rouge phénol pour obtenir une concentration de 10 à six cellules par millilitre. Diluer les cellules dans un milieu complet sans rouge de phénol. Voir les cellules goutte à goutte dans un mouvement circulaire dans un volume total de 35 microlitres par puits.
Incuber les cellules pendant une heure à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone. À 1,2 microlitre de matériau de sous-sol ECM à 23,8 microlitres de milieu complet sans rouge de phénol par puits, ce qui donne un volume final de 60 microlitres par puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone.
Le lendemain, remplacez le milieu par 100 microlitres de milieu complet sans phénol frais. Insérez la plaque de 96 puits contenant des sphéroïdes dans un microscope confocal à haute teneur. Sélectionnez les lasers appropriés pour exciter les sols utilisés.
Acquérir les canaux séquentiellement pour éviter la diaphonie, imager les sphéroïdes en utilisant des objectifs appropriés. Pour analyser la morphologie des sphéroïdes, segmentez les sphéroïdes en fonction de la FLoid conjuguée par fluorescence et de la coloration. Segmentez les noyaux en fonction de la coloration hexagonale trois, trois, trois, quatre, deux.
Segmentez le cytoplasme de chaque cellule par la coloration hexadécimale résiduelle trois, trois, quatre, deux, présente dans le cytoplasme cellulaire. Calculer différentes propriétés morphologiques des sphéroïdes, y compris le volume, la surface, la sphéricité et le nombre de noyaux par ses sphéroïdes. Ross a des images supplémentaires pour éliminer les sphéroïdes de moins de 75 micromètres cubes et de plus de 900 000 micromètres cubes.
Pour analyser une seule cellule dans les sphéroïdes, segmentez les sphéroïdes en fonction de la coloration sphéroïde conjuguée par fluorescence. Segmentez les noyaux en fonction de la coloration hexagonale trois, trois, trois, quatre, deux. Segmentez le cytoplasme de chaque cellule par la coloration hexadécimale résiduelle trois, trois, trois, quatre, deux qui est présente dans le cytoplasme cellulaire.
Segmenter les lysosomes en fonction de la coloration secondaire des anticorps. Calculer différentes propriétés morphologiques des cellules dans chaque sphéroïde, y compris le nombre de lysosomes par cellule, le volume cellulaire et la surface cellulaire. La figure montre bien des aperçus de trois types différents de sphéroïdes, y compris des images à différents plans confocaux.
Une vue volumétrique de l’ensemble des sphéroïdes est également montrée. La figure montre le processus de segmentation du pH, le panneau A montre l’ensemble des sphéroïdes dans une vue volumétrique. Le panneau B montre la segmentation définie du cytoplasme, des noyaux et des lysosomes dans toutes les cellules d’un seul sphéroïde.
Le cytoplasme et les noyaux sont segmentés en fonction de la coloration hexagonale trois, trois, trois, quatre, deux. Et les lysosomes sont segmentés en fonction de la coloration anticorps anti-laboratoire. Les panneaux C montrent le même segment que le panneau B, mais dans une vue à trois.
Diverses mesures morphologiques au niveau des sphéroïdes peuvent être effectuées. Ces mesures comprennent le calcul du nombre de noyaux par sphéroïdes, ainsi que de ces Felicity, volume et surface du pH. Volume typique de chaque cellule dans les trois types de sphéroïdes.
Ainsi que le nombre de lysosomes par cellule sont montrés dans cette figure. L’optimisation de la densité initiale des sièges de la cellule au début de la génération du SP est une étape critique. La figure montre que l’ajout de trop de cellules permet toujours la formation de sphéroïdes.
Cependant, cela peut entraîner la fusion si les sphéroïdes. Les sphéroïdes produits de cette manière peuvent être soumis à une analyse transcriptomique et protéomique. Cette technique est utilisée pour analyser quantitativement l’absorption de l’administration de médicaments tels que les nanoparticules et évaluer leur toxicité pour les cellules individuelles dans les sphéroïdes.
