このプロトコルは、自動顕微鏡検査に適したマルチウェルプレートの各ウェルにおいて数百の多細胞腫瘍性スフェロイドを産生する方法を提供する。産生された回転楕円体は、異なるサイズのクラスに分類することができ、細胞内情報をすべての細胞から抽出することができる。この技術は、直接スクリーニングおよびRNA干渉研究に使用できる十分な血清を産生する。
ECM地下室の材料を、マイナス20°Cに保たれた予めチルドチップを使用して、冷たいフェノールレッド無血清培地で希釈する。15マイクロリットルのECM地下材料と培地溶液を96ウェルイメージングプレートに賭ける。プレートを摂氏4度で91倍Gで20分間遠心分離する。
プレートを摂氏37度で30分以内にインキュベートする。トリップと EDTA をセルに追加します。インキュベーションの終了時に細胞を摂氏37度でインキュベートし、10%FBSを含む完全培地に細胞を懸濁する。
10マイクロリットルの細胞懸濁液をピペットで、血球計数計数器計数チャンバーに入れた。チャンバーの4象限内の細胞数をカウントする。セントラは、室温で4分間、135倍Gで細胞を見る。
この細胞をペレット化して1つ、上清を吸引し、フェノールレッドを含まない完全培地に細胞を再懸濁して、1ミリリットルあたり10〜6個の細胞の濃度を得る。フェノールレッドを含まない完全培地で細胞を希釈する。細胞が1ウェルあたり35マイクロリットルの総容量で円運動で滴下されるのを見てください。
細胞を5%の二酸化炭素で加湿したインキュベーター内で摂氏37度で1時間インキュベートする。1.2マイクロリットルのECM地下室材料で、ウェル当たり23.8マイクロリットルのフェノールレッドフリー完全培地まで、ウェル当たり60マイクロリットルの最終容量をもたらす。細胞を摂氏37度で、5%の二酸化炭素で加湿したインキュベーター内でインキュベートする。
翌日、培地を100マイクロリットルの新鮮なフェノールレッドを含まない完全培地と交換する。スフェロイドを含む96ウェルプレートを、共焦点高含有量スクリーニング顕微鏡に挿入する。使用する床を励起するために適切なレーザーを選択します。
クロストークを避けるためにチャンネルを順番に取得し、適切な目的を使用して回転楕円体を画像化します。スフェロイドの形態を分析するには、蛍光的に共役したFLoidと染色に基づいてスフェロイドをセグメント化します。16進数に基づいて核を3つ、3つ、3つ、4つ、2つの染色に基づいてセグメント化する。
各細胞の細胞質を3、3、4、2の残留六角形によってセグメント化し、細胞質内に存在する染色剤とする。体積、表面積、真球度、スフェロイドごとの核の数など、スフェロイドのさまざまな形態学的特性を計算します。ロスはさらに、75立方マイクロメートルより小さく、900,000立方マイクロメートルより大きい回転楕円体を除去する画像を有する。
スフェロイド内の単一細胞を分析するには、蛍光共役スフェロイド染色に基づいてスフェロイドをセグメント化します。16進数に基づいて核を3つ、3つ、3つ、4つ、2つの染色に基づいてセグメント化する。細胞質に存在する残留六角形の3つ、3つ、3つ、4つ、2つの染色によって各細胞の細胞質をセグメント化する。
二次抗体染色に基づいてリソソームをセグメント化する。細胞あたりのリソソームの数、細胞体積および細胞表面積を含む、各スフェロイド内の細胞の異なる形態学的特性を計算する。この図は、異なる共焦点面での画像を含む、3つの異なるタイプの回転楕円体の概要をよく示しています。
回転楕円体全体の体積図も表示されます。図はpHセグメンテーションプロセスを示し、パネルAは体積図におけるスフェロイド全体を示す。パネルBは、単一のスフェロイドのすべての細胞内の細胞質、核およびリソソームのセットセグメンテーションを表示する。
細胞質および核は、16進数3、3、3、4、2染色に基づいてセグメント化される。そしてリソソームは、抗ラボ一抗体染色に基づいてセグメント化される。パネル C は、パネル B と同じセグメント化されていますが、3 つのプレーンなビューで示されています。
回転楕円体レベルでの様々な形態学的測定が可能である。これらの測定には、スフェロイドあたりの核数の計算、ならびにこれらのpHのフェリシティ、体積、および表面積が含まれる。3つのスフェロイドタイプにおける各セルの典型的な体積。
細胞当たりのリソソームの数と同様に、この図に示されている。SP生成開始時の初期セル着座密度を最適化することは、重要なステップです。この図は、あまりにも多くの細胞を加えることで、依然としてスフェロイド形成を可能にすることを示している。
しかし、これは回転楕円体であれば融合を生じ得る。このようにして産生されるスフェロイドは、トランスクリプトームおよびプロテオミクス分析に供することができる。この技術は、薬物送達などのナノ粒子の取り込みを定量的に分析し、スフェロイド中の個々の細胞に対する毒性を評価するために使用される。
