פרוטוקול זה מספק שיטה לייצר כמה מאות כדוריות גידוליות רב-תאיות בכל באר של צלחת רב-באר המתאימה למיקרוסקופיה אוטומטית. ניתן לסווג את הספרואיד המיוצר למחלקות בגדלים שונים, וניתן לחלץ מידע תת-תאי מכל תא. הטכניקה מייצרת סרומים מספיקים שניתן להשתמש בהם במחקרי סינון ישיר והפרעות RNA.
מדלל חומר מרתף ECM במדיום אדום פנול קר ללא סום באמצעות טיפים צונן מראש נשמר במינוס 20 מעלות צלזיוס. אני מתערב על 15 מיקרוליטרים של חומר המרתף ECM ופתרון בינוני לתוך צלחת הדמיה 96 היטב. צנטריפוגה הצלחת במשך 20 דקות ב 91 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס.
לדגור על הצלחת במשך לא יותר מ 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוסף נסיעות ו- EDTA לתאים. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס בסוף הדגירה, אנו משעים את התאים במדיום שלם המכיל 10% FBS.
פיפטה 10 מיקרוליטרים של השעיית התא, לתוך תא ספירת המוציטומטר. ספור את מספר התאים בארבעה רבעים של התא. Centra צופה בתאים ב 135 פעמים G במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר.
אחד התאים האלה הם גלולה, לשאוף את supernatant מחדש resuspend התאים במדיום מלא אדום פנול כדי להשיג ריכוז של 10 עד שישה תאים למיליליטר. לדלל את התאים במדיום מלא מלא אדום פנול אדום פנול. ראה את התאים טיפה בתנועה מעגלית בנפח כולל של 35 מיקרוליטרים לבאר.
לדגור על התאים במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני. ב 1.2 מיקרוליטרים של חומר מרתף ECM ל 23.8 microliters של פנול אדום חינם בינוני מלא לכל באר, וכתוצאה מכך נפח סופי של 60 מיקרוליטרים לבאר. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני.
למחרת, להחליף את המדיום עם 100 microliters של פנול אדום טרי חינם בינוני מלא. הכנס את צלחת הבאר 96 המכילה כדוריות, למיקרוסקופ סינון תוכן גבוה קונפוקל. בחר את הלייזרים המתאימים כדי לרגש את הרצפות המשמשות.
לרכוש את הערוצים ברצף כדי למנוע crosstalk, תמונה spheroids באמצעות מטרות מתאימות. כדי לנתח את המורפולוגיה של כדוריות, פלח את הספרואידים המבוססים על פלואורסצנטיות מצומדות FLoid וכתמים. לפזר את הגרעינים על סמך הכישוף שלוש, שלוש, שלוש, ארבע, שתיים מכתימות.
פלח את הציטופלסמה של כל תא על ידי כישוף שיורית שלוש, שלוש, ארבע, שתיים, כתם שנמצא בציטופלסמה התא. חשב תכונות מורפולוגיות שונות של הספרואידים כולל נפח, שטח פנים, כדוריות ומספר הגרעינים לפי הספרואידים שלו. לרוס יש תמונות נוספות להסרת כדוריות הקטנות מ-75 מיקרומטר מעוקב ומיקרומטר מעוקב גדול מ-900,000 מ"ק.
כדי לנתח תא בודד בתוך כדוריות, פלח את הספרואידים בהתבסס על כתמי הספרואידים המצומדים בפלואורסצנטיות. לפזר את הגרעינים על סמך הכישוף שלוש, שלוש, שלוש, ארבע, שתיים מכתימות. פלח את הציטופלסמה של כל תא על ידי כישוף שיורית שלוש, שלוש, שלוש, ארבע, שתי כתם שנמצא בציטופלסמה התא.
פלח את הליזוזומים על סמך כתמי הנוגדנים המשניים. חשב תכונות מורפולוגיות שונות של התאים בתוך כל ספרואיד, כולל מספר הליזוזומים לכל תא, נפח התא ושטח הפנים של התא. האיור מציג סקירות טובות של שלושה סוגים שונים של כדוריות, כולל תמונות במישורים קונפוקליים שונים.
תצוגה נפחית של כל הספרואידים מוצגת גם היא. האיור מציג את תהליך פילוח ה- pH, לוח A מציג את כל הספרואידים בתצוגת נפח. לוח B מציג את הפילוח שנקבע של הציטופלסמה, הגרעינים והליזוזומים בתוך כל התאים של ספרואידים בודדים.
הציטופלסמה והגרעינים מחולקים על סמך הכישוף שלוש, שלוש, שלוש, ארבע, שתיים מכתימות. וליזוזומים מפולחים על סמך הכתמת נוגדן אנטי מעבדה אחת. חלוניות C מציגות את אותו מקטע כמו לוח B, אך בתצוגה של שלושה רגילים.
ניתן לבצע מדידות מורפולוגיות שונות ברמת הספרואידים. מדידות אלה כוללות חישוב של מספר הגרעינים לכל ספרואידים, כמו גם אלה פליסיטי, נפח, ושטח הפנים של pH. הנפח הטיפוסי של כל תא בשלושת סוגי הספרואידים.
כמו גם את מספר הליזוזומים לכל תא מוצגים באיור זה. מיטוב צפיפות הישיבה ההתחלתית של התא בתחילת דור SP הוא צעד קריטי. האיור מראה כי הוספת תאים רבים מדי עדיין מאפשרת היווצרות כדוריות.
עם זאת, זה יכול לגרום היתוך אם spheroids. Spheroids לייצר באופן זה יכול להיות נתון לניתוח תמלול ופרוטאומי. טכניקה זו משמשת לניתוח כמותי של ספיגת משלוח סמים חלקיקי ננו כאלה ולהעריך את הרעילות שלהם לתאים בודדים בספרואידים.
