يستخدم هذا البروتوكول تشعيع الضوء البنفسجي المرئي للحث على التحلل الضوئي أحادي النوكليوتيد فلافين. هذا ينتج كمية كبيرة من الجذور الحرة ، والتي تمنع البكتيريا المسببة للأمراض مثل المكورات العنقودية الذهبية و E.coli. لقد اختبرنا أحادي النوكليوتيد فلافين كحساس ضوئي مناسب.
في هذا البروتوكول ، نستخدم الضوء البنفسجي المرئي وهو آمن ولا يتطلب معدات باهظة الثمن. يمكن استخدام هذه الطريقة لعلاج الجلد المصاب أو الأنسجة المصابة تحت الجلد عن طريق إدخال ألياف بصرية للإضاءة. ويمكن أيضا أن تطبق على ممارسة الصرف الصحي في صناعة الأغذية.
سيكون عرض الإجراء هو Tang-Yu Chen ، طالب دراسات عليا من مختبري للبدء ، قم بتركيب ستة صمامات ثنائية باعثة للضوء تبلغ كل منها 12 فولت داخل كوب بلاستيكي غير شفاف. خذ أنبوب اختبار زجاجي قطره 13 ملليمترا وارتفاعه 100 ملليمتر وأضف المتفاعلات إلى الأنبوب. ثبت الأنابيب في الجزء العلوي من الكوب وضع هذا الإعداد عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 25 ثلاث درجات مئوية.
مراقبة وتسجيل درجة حرارة وحدات الاختبار خلال تفاعلات التحليل الضوئي بواسطة مقياس حرارة بالأشعة تحت الحمراء. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول FMN 0.1 مليمولار في محلول فوسفات البوتاسيوم 100 ملليمولار عند درجة الحموضة 7.8. قم بتعريض ثلاثة ملليلتر من عينات FMN لكل منها للضوء الأزرق أو الأخضر أو الأحمر أو البنفسجي لمدة خمس دقائق.
في موازاة ذلك ، احتفظ بثلاثة ملليلتر من محلول FMN في الظلام كعنصر تحكم. ضع العينة في مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية وسجل امتصاص العينات المشععة في نطاق 250 إلى 750 نانومتر. للتحضير للكشف عن جذور الأكسيد الفائق ، أضف أولا 109.3 ملليغرام من L-methionine إلى 73.3 ملليلتر من محلول فوسفات 100 مليمولار عند درجة الحموضة 7.8.
في المحلول ، أضف 10 ملليغرام من مسحوق NBT و 1.5 ملليلتر من 0.117 ملليمولار FMN. قم بتعريض ملليلتر واحد من محلول التفاعل لضوء LED الأزرق أو البنفسجي لمدة دقيقة إلى خمس دقائق. سجل امتصاص 516 نانومتر للكشف عن الفورمازان ، والذي ينتج عن التفاعل الكيميائي الضوئي ل NBT.
قم بتلقيح مستعمرة من المكورات العنقودية الذهبية إلى 10 ملليلتر من مرق الليزوجيني في أنبوب اختبار مغطى بغطاء لولبي سعة 15 ملليلتر. تنمو الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة في شاكر. نقل 0.5 ملليلتر من الثقافة إلى أنبوب طرد مركزي 1.5 ملليلتر.
تمييع الثقافة إلى كثافة بصرية من 0.5 في 600 نانومتر عن طريق إضافة الماء المعقم. بعد ذلك ، انقل 0.5 ملليلتر من الثقافة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر. جهاز طرد مركزي في 14،000 G لمدة 10 دقائق وصب الطاف.
أضف ملليلتر واحد من محلول FMN المخزن مؤقتا إلى حبيبات الخلية والدوامة. للتحكم في الإشعاع ، أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للفوسفات. انقل ملليلتر واحد من محلول الخلايا البكتيرية الذي يحتوي على 30 ميكرومولار FMN وعازلة الفوسفات إلى أنابيب زجاجية.
ضعها للإشعاع تحت الضوء البنفسجي عند 10 واط لكل متر مربع لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، انقل ملليلترا واحدا من محلول الخلايا البكتيرية الذي يحتوي على 30-60 و 120 ميكرومولار FMN ومخزن الفوسفات في أنابيب زجاجية. تشعيع بالضوء الأزرق لمدة 120 دقيقة عند 20 واط لكل متر مربع.
أيضا ، قم بتشعيع أنبوب يحتوي على ملليلتر واحد من FMN 120 ميكرومولار لمدة 60 دقيقة. بعد التشعيع ، أضف 0.2 ملليلتر من محلول التفاعل على صفيحة أجار لوريا. انشر المحلول باستخدام قضيب زجاجي على شكل حرف L واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
في اليوم التالي ، احسب عدد الألواح القابلة للحياة ومعدل تعطيل المكورات العنقودية الذهبية. تحضير عينات المكورات العنقودية الذهبية كما هو موضح سابقا للحصول على حبيبات الخلية. إلى 75 ملليلتر من الفوسفات العازلة إضافة 0.1093 غرام من L-ميثيونين، 0.1 غرام من NBT، و 25 ملليلتر من محلول FMN.
أضف ملليلترا واحدا من كل محلول متفاعل بتركيزات FMN متفاوتة إلى الكريات الخلوية والدوامة. قم بتشعيع المحاليل تحت الضوء البنفسجي بمعدل 10 واط لكل متر مربع لمدة 10 دقائق. الطرد المركزي الخليط في 14،000 غرام لمدة 10 دقائق وصب طاف .
أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من ثنائي ميثيل سلفوكسيد لاستخراج NBT المختزل. سجل الامتصاص عند 560 نانومتر. لم يظهر تشعيع FMN بالضوء الأخضر والأحمر أي تأثير على القمم عند 372 و 444 نانومتر مقارنة بالتحكم الداكن ، في حين لوحظ انخفاض امتصاص FMN عند 444 نانومتر تحت الضوء الأزرق والبنفسجي ، مما يشير إلى زيادة التحلل الضوئي.
تم الكشف عن جذور الأكسيد الفائق التي تشكلت أثناء التحلل الضوئي FMN تحت الضوء الأزرق أو البنفسجي باستخدام اختزال NBT. كان التأثير الكيميائي الضوئي ل FMN يعتمد على وقت التشعيع. أدى التحلل الضوئي FMN باستخدام تشعيع الضوء الأزرق أو البنفسجي إلى تعطيل كبير للمكورات العنقودية الذهبية.
لوحظ تعطيل يعتمد على الجرعة لتشعيع الضوء الأزرق ، مع تحقيق تعطيل بنسبة 97٪ ل FMN 120 ميكرومولار. تحت الضوء البنفسجي ، تم تحقيق معدل تعطيل بنسبة 96٪ للمكورات العنقودية الذهبية ، مع 30 ميكرومولار FMN تظهر فعالية أعلى لتعطيل البكتيريا. أظهر تقليل NBT أن التأثير الضوئي ل FMN تحت الضوء البنفسجي في المكورات العنقودية الذهبية كان متناسبا مع تركيز FMN.
في الحالات غير المعالجة ، تمت الإشارة إلى وفرة أقل من جذور الأكسيد الفائق من خلال الامتصاص المنخفض عند 560 نانومتر ، في حين أظهرت قيم الامتصاص الأعلى في معالجة FMN إنتاجا وفيرا لجذور الأكسيد الفائق ، مما أدى إلى زيادة التأثير الكيميائي الضوئي. من الأهمية بمكان أن يكون لديك مصدر ضوء LED جيد. يجب أن يكون العرض الطيفي لنظام الضوء البنفسجي ضيقا لتجنب أي تداخل مع امتصاص الأشعة فوق البنفسجية ، لأن الأشعة فوق البنفسجية قد تكون خطرة.
بعد الإجراء ، يمكن اختبار المركبات الكيميائية الأخرى مثل التتراسيكلين ، الدوكسيسيكلين ، الكاتشين ، للتحلل الضوئي المشابه ل FMN.
