Этот протокол использует облучение видимым фиолетовым светом, чтобы индуцировать фотолиз флавина мононуклеотида. При этом образуется большое количество свободных радикалов, которые ингибируют патогенные бактерии, такие как золотистый стафилококк и E.coli. Мы протестировали мононуклеотид флавина в качестве подходящего фотосенсибилизатора.
В этом протоколе мы используем видимый фиолетовый свет, который безопасен и не требует дорогостоящего оборудования. Этот метод может быть использован для терапии поврежденной кожи или инфицированных подкожных тканей путем введения оптического волокна для освещения. Он также может быть применен к санитарной практике в пищевой промышленности.
Продемонстрировать процедуру будет Тан-Юй Чен, аспирант из моей лаборатории Для начала установите шесть светодиодов по 12 вольт каждый на внутренней стороне непрозрачного пластикового стаканчика. Возьмите стеклянную пробирку диаметром 13 миллиметров и высотой 100 миллиметров и добавьте в трубку реагенты. Закрепите трубки в верхней части чашки и поместите эту установку при постоянной температуре 25 три градуса Цельсия.
Контролируйте и регистрируйте температуру испытательных блоков на протяжении всех фотолитических реакций с помощью инфракрасного термометра. Далее готовят 0,1-миллимолярный раствор FMN в 100-миллимолярном буфере фосфата калия при рН 7,8. Подвергайте три миллилитра образцов FMN воздействию синего, зеленого, красного или фиолетового света в течение пяти минут.
Параллельно держите три миллилитра раствора FMN в темноте в качестве контроля. Поместите образец в видимый УФ-излучением спектрофотометр и запишите поглощение облученных образцов в диапазоне от 250 до 750 нанометров. Чтобы подготовиться к обнаружению супероксидных радикалов, сначала добавляют 109,3 миллиграмма L-метионина к 73,3 миллилитрам 100-миллимолярного фосфатного буфера при рН 7,8.
В раствор добавляют 10 миллиграммов порошка NBT и 1,5 миллилитра 0,117-миллимолярного FMN. Подвергайте один миллилитр реакционного раствора воздействию синего или фиолетового светодиодного света в течение одной-пяти минут. Запишите поглощение 516 нанометров для обнаружения формазана, который образуется в результате фотохимической реакции NBT.
Инокулируют колонию золотистого стафилококка в 10 миллилитров лизогенного бульона в 15-миллилитровой пробирке с завинчивающейся крышкой. Выращивайте культуру при 37 градусах Цельсия в течение 16 часов в шейкере. Переложите 0,5 миллилитра культуры в 1,5-миллилитровую центрифужную трубку.
Разбавить культуру до оптической плотности 0,5 при 600 нанометрах, добавив стерилизованную воду. Затем переложите 0,5 миллилитра культуры в 1,5-миллилитровую центрифужную трубку. Центрифуга при 14 000 G в течение 10 минут и декантирование супернатанта.
Добавьте один миллилитр буферного раствора FMN к ячейке гранулы и вихря. Для облученного контроля добавьте один миллилитр фосфатного буфера. Переложить один миллилитр раствора бактериальных клеток, содержащего 30-микромолярный FMN и фосфатный буфер, в стеклянные трубки.
Поместите их для излучения под фиолетовым светом со скоростью 10 Вт на квадратный метр в течение 30 минут. Затем переложить один миллилитр бактериального клеточного раствора, содержащего 30-60- и 120-микромолярный FMN и фосфатный буфер, в стеклянные трубки. Облучение синим светом в течение 120 минут при 20 Вт на квадратный метр.
Также облучают трубку, содержащую один миллилитр 120-микромолярного FMN в течение 60 минут. После облучения добавляют 0,2 миллилитра реакционного раствора на пластину лурия-агара. Выкладываем раствор с помощью L-образного стеклянного стержня и инкубируем в течение ночи при 37 градусах Цельсия.
На следующий день рассчитайте количество жизнеспособных пластин и скорость инактивации золотистого стафилококка. Подготовьте образцы золотистого стафилококка, как описано ранее, для получения клеточной гранулы. К 75 миллилитрам фосфатного буфера добавляют 0,1093 г L-метионина, 0,1 грамма NBT и 25 миллилитров раствора FMN.
Добавьте по одному миллилитру каждого раствора реагента с различными концентрациями FMN в гранулы ячейки и вихрь. Облучайте растворы под фиолетовым светом со скоростью 10 Вт на квадратный метр в течение 10 минут. Центрифугируйте смесь в 14 000 г в течение 10 минут и декантируйте супернатант.
Повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре диметилсульфоксида для извлечения восстановленного NBT. Запишите поглощение на 560 нанометров. Облучение FMN зеленым и красным светом не оказало влияния на пики на 372 и 444 нанометра по сравнению с темным контролем, тогда как снижение поглощения FMN на 444 нанометра наблюдалось при синем и фиолетовом свете, что указывает на усиление фотолиза.
Обнаружение супероксидных радикалов, образующихся при фотолизе FMN при синем или фиолетовом свете, производилось с использованием восстановления NBT. Фотохимический эффект FMN зависел от времени облучения. Фотолиз FMN с использованием облучения синим или фиолетовым светом привел к значительной инактивации золотистого стафилококка.
Дозозависимая инактивация наблюдалась для облучения синим светом, причем 97% инактивация достигалась для 120-микромолярного FMN. При фиолетовом свете скорость инактивации 96% была достигнута для золотистого стафилококка, причем 30-микромолярный FMN показал более высокую эффективность для бактериальной инактивации. Снижение NBT показало, что фотолитический эффект FMN при фиолетовом свете у золотистого стафилококка был пропорционален концентрации FMN.
В необработанных условиях более низкое содержание супероксидных радикалов было отмечено низкой абсорбцией на 560 нанометров, тогда как более высокие значения абсорбции при обработке FMN показали обильное производство супероксидных радикалов, что привело к увеличению фотохимического эффекта. Очень важно иметь хороший светодиодный источник света. Спектральная ширина режима фиолетового света должна быть узкой, чтобы избежать любого перекрытия с поглощением ультрафиолета, так как ультрафиолетовое излучение может быть опасным.
После процедуры другие химические соединения, такие как тетрациклин, доксициклин, катехин, могут быть проверены на фотолиз, аналогичный FMN.
