このプロトコルは、可視紫色光照射を使用してフラビンモノヌクレオチド光分解を誘導します。これにより、黄色ブドウ球菌や大腸菌などの病原菌を阻害する大量のフリーラジカルが生成されます。適切な光増感剤としてフラビンモノヌクレオチドをテストしました。
このプロトコルでは、安全で高価な機器を必要としない可視紫色光を使用します。この方法は、照明用の光ファイバーを挿入することにより、損傷した皮膚または感染した皮下組織の治療に使用できます。また、食品産業における衛生慣行にも適用できます。
手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるTang-Yu Chenです まず、不透明なプラスチックカップの内側にそれぞれ12ボルトの6つの発光ダイオードを取り付けます。直径13ミリメートル、高さ100ミリメートルのガラス試験管を取り、反応物をチューブに加えます。チューブをカップの上部に固定し、このセットアップを摂氏25度3度の一定温度に置きます。
赤外線温度計による光分解反応全体のテストユニットの温度を監視および記録します。次に、pH 7.8で100ミリモルのリン酸カリウム緩衝液中の0.1ミリモルFMN溶液を調製します。3ミリリットルのFMNサンプルをそれぞれ青、緑、赤、または紫の光に5分間さらします。
並行して、コントロールとして3ミリリットルのFMN溶液を暗所に保ちます。サンプルを紫外可視分光光度計に入れ、照射されたサンプルの吸光度を250〜750ナノメートルの範囲で記録します。スーパーオキシドラジカルの検出を準備するには、まずpH 7.8で109.3ミリグラムのL-メチオニンを73.3ミリリットルの100ミリモルリン酸緩衝液に加えます。
溶液に、10ミリグラムのNBT粉末と1.5ミリリットルの0.117ミリモルFMNを加える。1ミリリットルの反応液を青色または紫色のLEDライトに1〜5分間さらします。516ナノメートルの吸光度を記録して、NBTの光化学反応によって生成されるホルマザンを検出します。
黄色ブドウ球菌のコロニーを、15ミリリットルのスクリューキャップ付き試験管内の10ミリリットルのリソゲンブロスに接種します。シェーカーで16時間摂氏37度で培養物を育てます。0.5ミリリットルの培養液を1.5ミリリットルの遠沈管に移します。
滅菌水を加えて、培養液を600ナノメートルで0.5の光学密度に希釈します。次に、0.5ミリリットルの培養物を1.5ミリリットルの遠沈管に移します。14, 000 Gで10分間遠心分離し、上清をデカントします。
1ミリリットルのFMN緩衝溶液をセルペレットとボルテックスに加えます。照射対照のために、1ミリリットルのリン酸緩衝液を加える。30マイクロモルのFMNとリン酸緩衝液を含む1ミリリットルの細菌細胞溶液をガラス管に移します。
紫色の光の下で10ワット/平方メートルで30分間放射線のためにそれらを置きます。次に、30-60-および120-マイクロモルのFMNとリン酸緩衝液を含む1ミリリットルの細菌細胞溶液をガラス管に移します。1平方メートルあたり20ワットで120分間青色光を照射します。
また、1ミリリットルの120マイクロモルFMNを入れたチューブに60分間照射する。照射後、反応液0.2ミリリットルをルリア寒天プレートに加える。L字型のガラス棒を使用して溶液を広げ、摂氏37度で一晩インキュベートします。
翌日、黄色ブドウ球菌の生存可能なプレート数と不活性化率を計算します。前述のように黄色ブドウ球菌サンプルを調製し、細胞ペレットを得た。75ミリリットルのリン酸緩衝液に、0.1093グラムのL-メチオニン、0.1グラムのNBT、および25ミリリットルのFMN溶液を加える。
FMN濃度を変化させた各反応液1ミリリットルをセルペレットと渦に加えます。紫色光の下で10ワット/平方メートルの溶液を10分間照射します。混合物を14, 000 Gで10分間遠心分離し、上清をデカントします。
ペレットを1ミリリットルのジメチルスルホキシドに再懸濁して、還元されたNBTを抽出します。560ナノメートルの吸光度を記録します。FMNに緑光と赤光を照射しても、暗対照と比較して372ナノメートルと444ナノメートルのピークに影響は見られませんでしたが、青光と紫色光では444ナノメートルのFMNの吸光度の低下が観察され、光分解の増加が示されました。
青色または紫色光下でのFMN光分解中に形成されるスーパーオキシドラジカルの検出は、NBT還元を使用して行われました。FMNの光化学的効果は照射時間に依存していた。青色または紫色の光照射を用いたFMN光分解は、黄色ブドウ球菌の有意な不活性化をもたらした。
青色光照射では線量依存的な不活性化が観察され、120マイクロモルのFMNでは97%の不活性化が達成されました。紫色光下では、黄色ブドウ球菌で96%の不活化率が達成され、30マイクロモルのFMNは細菌の不活性化に対してより高い有効性を示しました。NBTの減少は、黄色ブドウ球菌における紫色光下でのFMNの光分解効果がFMN濃度に比例することを示した。
未処理条件では、スーパーオキシドラジカルの存在量が少ないほど560ナノメートルの吸光度が低いことが示されましたが、FMN処理の吸光度値が高いほど、スーパーオキシドラジカルが豊富に生成され、光化学的効果が増加しました。優れたLED光源を用意することが重要です。紫外線は危険である可能性があるため、紫色光領域のスペクトル幅は、UV吸収との重なりを避けるために狭くする必要があります。
手順に続いて、他の化合物、例えばテトラサイクリン、ドキシサイクリン、カテキン、およびFMNと同様の光分解について試験することができる。
