פרוטוקול זה משתמש בהקרנה של אור סגול נראה כדי לגרום לפוטוליזה של פלווין מונונוקלאוטיד. זה מייצר כמות גדולה של רדיקלים חופשיים, אשר מעכבים חיידקים פתוגניים כגון Staphylococcus aureus ו E.coli. בדקנו פלווין מונונוקלאוטיד כפוטוסנסיטייזר מתאים.
בפרוטוקול זה אנו משתמשים באור סגול נראה שהוא בטוח ואינו דורש ציוד יקר. שיטה זו יכולה לשמש לטיפול בעור פצוע או ברקמות תת עוריות נגועות על ידי החדרת סיב אופטי לתאורה. זה יכול להיות מיושם גם בפועל תברואה בתעשיית המזון.
המדגים את ההליך יהיה טאנג-יו צ'ן, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי כדי להתחיל, להרכיב שש דיודות פולטות אור של 12 וולט כל אחת על החלק הפנימי של פלסטיק אטומה. קח מבחנה זכוכית בקוטר של 13 מילימטרים וגובה של 100 מילימטרים והוסף את המגיבים לצינור. מהדקים את הצינורות בחלק העליון של הכוס ומניחים את המערך בטמפרטורה קבועה של 25 שלוש מעלות צלזיוס.
נטר ורשום את הטמפרטורה של יחידות הבדיקה לאורך התגובות הפוטוליטיות על ידי מדחום אינפרא אדום. לאחר מכן, הכן תמיסת FMN של 0.1 מילימולר במאגר פוספט אשלגן 100-מילימולרי ב- pH 7.8. חשוף שלוש מיליליטר של דגימות FMN כל אחת לאור כחול, ירוק, אדום או סגול למשך חמש דקות.
במקביל, שמור על שלושה מיליליטר של תמיסת FMN בחושך כבקרה. מקם את הדגימה בספקטרופוטומטר הנראה לעין UV ותעד את הקליטה של דגימות מוקרנות בטווח של 250 עד 750 ננומטר. כדי להתכונן לזיהוי רדיקלים סופראוקסיד, תחילה הוסיפו 109.3 מיליגרם של L-מתיונין ל-73.3 מיליליטר של חיץ פוספט 100 מילימולרי ב-pH 7.8.
לתוך הפתרון, להוסיף 10 מיליגרם של אבקת NBT ו 1.5 מיליליטר של 0.117-מילימולר FMN. חשוף מיליליטר אחד מתמיסת התגובה לאור LED כחול או סגול למשך דקה עד חמש דקות. רשום את הספיגה של 516 ננומטר כדי לזהות פורמאזן, אשר מיוצר על ידי התגובה הפוטוכימית של NBT.
לחסן מושבה של סטפילוקוקוס אאורוס לתוך 10 מיליליטר של מרק ליזוגני במבחנה 15 מיליליטר בורג מכסה. לגדל את התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות בשייקר. מעבירים 0.5 מיליליטר מהתרבית לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.
לדלל את התרבית לצפיפות אופטית של 0.5 ב-600 ננומטר על ידי הוספת מים מעוקרים. לאחר מכן, העבר 0.5 מיליליטר מהתרבית לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב 14, 000 G במשך 10 דקות ו decant את supernatant.
הוסף מיליליטר אחד של תמיסה חוצצת FMN לכדור התא ולמערבולת. עבור שליטה מוקרנת, להוסיף מיליליטר אחד של חיץ פוספט. העבר מיליליטר אחד של תמיסת תאים חיידקיים המכילה FMN 30-micromolar וחיץ פוספט לתוך צינורות זכוכית.
מניחים אותם לקרינה תחת אור סגול ב 10 וואט למטר מרובע במשך 30 דקות. לאחר מכן, העבר מיליליטר אחד של תמיסת תאי חיידקים המכילה 30-60-ו-120-micromolar FMN וחיץ פוספט בצינורות זכוכית. להקרין עם אור כחול במשך 120 דקות ב 20 וואט למטר מרובע.
כמו כן, להקרין צינור המכיל מיליליטר אחד של 120-micromolar FMN במשך 60 דקות. לאחר ההקרנה, להוסיף 0.2 מיליליטר של תמיסת התגובה על צלחת לוריא אגר. מורחים את התמיסה באמצעות מוט זכוכית בצורת L ודוגרים למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.
למחרת, לחשב את ספירת צלחת קיימא ואת שיעור ההשבתה של Staphylococcus aureus. הכן את דגימות הסטפילוקוקוס אאורוס כפי שתואר קודם לכן כדי לקבל כדור תא. ל 75 מיליליטר של חיץ פוספט להוסיף 0.1093 גרם של L-מתיונין, 0.1 גרם של NBT, ו 25 מיליליטר של תמיסת FMN.
הוסף מיליליטר אחד מכל תמיסה מגיבה עם ריכוזי FMN משתנים לכדורי התא ולמערבולת. להקרין את התמיסות תחת אור סגול ב 10 וואט למטר מרובע במשך 10 דקות. צנטריפוגה את התערובת ב 14, 000 גרם במשך 10 דקות ו decant את supernatant.
יש להשהות את הכדור במיליליטר אחד של דימתיל סולפוקסיד כדי לחלץ את ה-NBT המופחת. רשום את הספיגה ב-560 ננומטר. הקרנה של FMN עם אור ירוק ואדום לא הראתה השפעה על הפסגות ב-372 ו-444 ננומטר בהשוואה לבקרה כהה, בעוד שההפחתה בספיגה של FMN ב-444 ננומטר נצפתה תחת אור כחול וסגול, מה שמעיד על פוטוליזה מוגברת.
זיהוי רדיקלים סופראוקסיד שנוצרו במהלך פוטוליזה של FMN תחת אור כחול או סגול נעשה באמצעות הפחתת NBT. ההשפעה הפוטוכימית של FMN הייתה תלויה בזמן ההקרנה. פוטוליזה של FMN באמצעות קרינת אור כחול או סגול גרמה להשבתה משמעותית של סטפילוקוקוס אאורוס.
אי-פעילות תלוית מינון נצפתה עבור הקרנה של אור כחול, עם 97% אי-פעילות שהושגה עבור FMN של 120 מיקרומולר. תחת אור סגול, הושג שיעור אי-פעילות של 96% עבור סטפילוקוקוס אאורוס, כאשר FMN של 30-micromolar הראה יעילות גבוהה יותר עבור השבתת חיידקים. הפחתת NBT הראתה כי ההשפעה הפוטוליטית של FMN תחת אור סגול בסטפילוקוקוס אאורוס הייתה פרופורציונלית לריכוז FMN.
בתנאים שלא טופלו, שפע נמוך יותר של רדיקלים סופראוקסיד צוין על ידי ספיגה נמוכה של 560 ננומטר, בעוד שערכי ספיגה גבוהים יותר בטיפול FMN הראו ייצור שופע של רדיקלים סופראוקסיד, וכתוצאה מכך אפקט פוטוכימי מוגבר. זה קריטי שיהיה לך מקור אור LED טוב. הרוחב הספקטרלי של משטר האור הסגול חייב להיות צר כדי למנוע חפיפה עם ספיגת UV, מכיוון שקרינת UV עלולה להיות מסוכנת.
בעקבות ההליך, תרכובות כימיות אחרות כגון טטרציקלין, דוקסיציקלין, קטכין, וניתן לבדוק אותן לפוטוליזה בדומה ל- FMN.
